Bu koala kürk gelen glukokortikoid hormonu, kortizol, değerlendirilmesi için yeni bir yöntemdir. Koalalarda kronik stresin değerlendirilmesi için yeni bir biyomarker sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, numune hazırlama ve hormon telbette arasında oldukça hızlı bir dönüş süresi ile son derece hassas ve tekrarlanabilir bir yöntem olmasıdır.
Bu teknik koalalarda kronik stresin kantitatif değerlendirmesine olanak sağlar, bu da son derece yararlı bir klinik yönetim aracıdır. Bu prosedürde bana yardım dylan Fox, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi. Bu işlem başlamak için eksi 80 santigrat derece de depolama kürk almak ve oda sıcaklığında çözülme izin.
Daha sonra, bir laboratuvar analitik hassas denge üzerinde kürk tartın. Kürkün 60 miligramını önceden tartılmış ve etiketli 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin ve 18 tüp dolana kadar bunu tekrarlayın. Bir pipet kullanarak, her tüp için% 100 HPLC sınıf isopropanol bir mililitre ekleyin.
30 saniye boyunca örnekleri girdap. Sıvı ve kürk ayrımını sağlamak için her numuneyi 0,5 mililitrelik mikro hassasiyetli bir elek ile süzün ve sıvıyı bir atık kabına atın. Her kürk örneğini etiketli plastik bir tartı teknesine yerleştirin.
Sonra bir vakum desiccator içine tartMa tekneler yerleştirin ve kürk kurumasını sağlamak için üç gün bekletin. Kürk tamamen kurudıktan sonra, her numuneyi etiketli 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Her numuneyi üç krom çelik boncuklu bir boncuk değirmenine yerleştirin ve saniyede 30 titremeyle iki dakika toz haline getirin.
18 toplam tüp doldurulana kadar %100 analitik sınıf metanol ve %100 analitik sınıf izopropanol ile bu transferi tekrarlayın. Bundan sonra, kürk örneğini içeren altı adet 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne ilk ekstraksiyon tekniğinin bir mililitresini aktarmak için bir pipet kullanın. Kapak her tüp, ve en az 12 saat boyunca sürekli zonklayan oda sıcaklığında onları kuluçkaya bir shaker kullanın.
Daha sonra numuneleri 0,5 mililitrelik mikro hassasiyetli elek ile süzün. Kürk uygun atılır sağlarken, yeni etiketli 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine sıvı aktarmak için bir pipet kullanın. Bir duman kaputunda, tamamen azot buharı akışı altında solvent ekstresi deneyin.
Daha sonra, 400 mikrolitre analiz tamponu ve 100 mikrolitre %100 analitik sınıf etanol ile kurutulmuş numuneyi yeniden oluşturun. Kontrolleri yapmak için, ilk olarak strese maruz kalarak bilinen hayvanlardan örnekler seçin. Bir ekstre havuzu yapmak için, 200 mikrolitre toplam hacmi elde edilene kadar her örnekten 20 mikrolitre ekstresi alın.
Ayıklama havuzunu, tahlilleri çalıştırmaya hazır olana kadar eksi 80 derecede saklayın. Hazır olduğunuzda, kortizol standardına karşı ekstre için paralellik grafiğinden %30 ve %70 bağlama noktaları için seyreltme faktörü alın ve yüksek ve düşük kontrolleri oluşturmak için numune havuzunu uygun şekilde seyreltmek için test arabelleği kullanın. Ticari bir kortizol kiti kullanarak numuneler, kontroller, kortizol standartları, spesifik olmayan bağlayıcı kuyular ve tedarikçinin talimatlarına göre maksimum bağlayıcı kuyuları içeren 96 kuyulu bir şerit plaka sıca.
Örneklerin, denetimlerin ve standartların konumlarını listelemek için kit kitapçıkta yer alan plaka düzeni sayfasını kullanın. Daha sonra, %100 metanol ekstresi koala kürkü elde etmek için daha önce açıklanan kürk hormonu ekstraksiyon işlemini takip edin. Kortizol kitinin reaktiflerini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
Pipet plaka kuyularına 50 mikrolitre numune veya standart. Pipet 75 mikrolitre nonspesifik bağlayıcı kuyulara arabellek ve maksimum bağlayıcı kuyulara 50 mikrolitre talaş tamponu. Tekrarlayıcı pipet kullanarak her kuyuya 25 mikrolitre kortizol ekleyin.
Daha sonra, pipet 25 mikrolitre kortizol antikor her kuyuiçine, nonspesifik bağlayıcı kuyular hariç. Reaktiflerin iyice karıştırıldığından emin olmak için plakanın kenarlarına hafifçe dokunun. Plakayı plaka lı kapatıcı ile kapatın ve oda sıcaklığında bir saat sallamak için orbital shaker kullanın.
Bundan sonra, plaka mührünü çıkarın ve her kuyuyu 300 mikrolitre yıkama tamponu ile dört kez yıkayarak kuyu plakasını aspire edin. Daha sonra temiz emici havlular üzerine dokunarak plaka kuru. Pipet 100 mikrolitre tetrametilbenzidin her kuyuya substrat.
Plakalı inisini kuyu tabağına yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, pipet 50 mikrolitre stop çözeltisi her kuyuya. Plakayı 450 nanometre okuyabilen bir plaka okuyucusuna aktarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi son hormon konsantrasyonu hesaplayın.
Bu çalışmada, ilgi hormon metabolitlerinin deneme tespiti paralellik kullanılarak belirlenir. Paralellik eğrisinde, %50 bağlama noktası standart eğrideki örnek seyreltme faktörünü belirler. Görüldüğü gibi, %100 etanol ve %100 izopropanol ekstreleri kortizol standardına paralel deplasman sağlamamıştır.
Ancak, % 100 metanol ekstresi kortizol standardına paralel deplasman sağlar. Tüm tahlillerde çalışan yüksek ve düşük bağlayıcılı numune ekstrelerinden varyasyonun intra-ve inter-tahlil katsayıları belirlenir. Düşük bağlayıcı iç kontroller düzgün koala özü havuzu olarak görülürken, yüksek bağlayıcı iç kontroller bir-iki seyreltilmiş koala ekstresi havuzu olarak görülmektedir.
Her çözücü özü ve kortizol standardı arasındaki ilişki daha sonra bir regresyon çizimi kullanılarak belirlenir. %100 metanol ekstresi% 100 etanol ve% 100 izopropanol özleri ile karşılaştırıldığında en yüksek R kare değeri ile regresyon en iyi çizgi sağlar. Bu örnek yıkama adımı steroid hormonların kaybını önlemek için örnekleri taşlama önce yapılması gerektiğini hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, diğer steroid hormonları ölçebilirsiniz, üreme hormonları gibi koalalar stres ve üreme arasındaki etkileşimleri bakmak için. Bu teknik, koala kürkü kortizolnon-invaziv değerlendirme sağlayan, koruma fizyolojisi gelişmekte olan alan için yeni bir araç sağlar. Ticari kortizol kiti dakika miktarı reaktifler sağlar.
Ancak, bu laboratuvar prosedürünü yürütürken kendine zarar vermek için kişisel koruyucu ekipman giymek önemlidir.
