Это новый метод оценки глюкокортикоидного гормона, кортизола, из меха коалы. Он предоставляет новый биомаркер для оценки хронического стресса у коал. Основным преимуществом этой техники является то, что это очень чувствительный и воспроизводимый метод с довольно быстрым временем оборота между подготовкой образца и гормональным анализом.
Этот метод позволяет количественно оценить хронический стресс у коал, который является весьма полезным инструментом клинического управления. Помочь мне с этой процедурой - Дилан Фокс, аспирант из моей лаборатории. Для начала этой процедуры извлекаем мех из хранилища при температуре минус 80 градусов по Цельсию и дайте ему оттаять при комнатной температуре.
Затем взвесь мех на лабораторно-аналитическом балансе точности. Поместите 60 миллиграммов меха в предварительно взвешенную и помеченную 1,5-миллилитровую центрифугу и повторите это до тех пор, пока не будут заполнены 18 трубок. Используя пипетку, добавьте один миллилитр 100%HPLC класса изопропанол к каждой трубке.
Вихрь образцов в течение 30 секунд. Процедить каждый образец с 0,5-миллилитровым микроточной сито, с тем чтобы добиться разделения жидкости и меха, и выбросить жидкость в контейнер для отходов. Поместите каждый образец меха в помеченную пластиковую лодку для взвешивания.
Затем поместите лодки для взвешивания в вакуумный децикатор и оставьте на три дня, чтобы мех высох. После того, как мех полностью высохнет, поместите каждый образец в помеченную 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Поместите каждый образец в бисерную мельницу с тремя хромированными стальными бусинками и распылизуйте в течение двух минут при 30 коктейлях в секунду.
Повторите эту передачу со 100%-ным аналитическим метанолом и 100%-ным аналитическим сортом изопропанола до тех пор, пока не будет заполнено 18 трубок. После этого используйте пипетку для переноса одного миллилитра первой техники экстракции в шесть 1,5-миллилитровых центрифугных трубок, содержащих образец меха. Cap каждой трубки, и использовать шейкер, чтобы инкубировать их при комнатной температуре с постоянной пульсирующей, по крайней мере 12 часов.
Затем процедить образцы с 0,5-миллилитровый микро-точность сито. Используйте пипетку для переноса жидкости в новую помеченную микроцентрифугную трубку с маркировкой 1,5 миллилитров, обеспечивая при этом, чтобы мех был надлежащим образом выброшен. В дымовой капот, полностью попробуйте экстракт растворителя под потоком пара азота.
Затем воссоздать высушенный образец с 400 микролитров анализа буфера и 100 микролитров 100% этанола аналитического класса. Чтобы сделать элементы управления, сначала выберите образцы у животных с известным воздействием стрессора. Чтобы сделать экстракт бассейн, возьмите 20 микролитров экстракта из каждой выборки, пока общий объем 200 микролитров не будет получен.
Храните экстракт бассейн при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к запуску анализов. Когда вы будете готовы, получить фактор разбавления для 30%и 70%binding точек от параллелизма график для экстракта против кортизола стандарта, и использовать анализ буфера для разбавления образца бассейн надлежащим образом для создания высоких и низких элементов управления. Используя коммерческий комплект кортизола создали 96-хорошо полоса пластины, включая образцы, контроль, кортизол стандартов, неспецифических обязательных скважин, и максимально связывающих скважин в соответствии с инструкциями поставщика.
Используйте лист макета пластины, включенный в буклет комплекта, чтобы перечислить положения образцов, элементов управления и стандартов. Затем следуйте описанной ранее процессу извлечения меховых гормонов, чтобы получить 100%-ный мех коалы, извлеченный метанолом. Подготовь реагенты комплекта кортизола в соответствии с инструкциями производителя.
Pipette 50 микролитров образцов или стандартов в колодцы пластины. Пипетт 75 микролитров анализа буфера в неспецифических связывающих скважин, и 50 микролитров анализа буфера в максимально связывающих скважин. Использование ретранслятора пипетки добавить 25 микролитров кортизола конъюгации к каждой хорошо.
Затем, пипетки 25 микролитров антитела кортизола в каждой скважине, за исключением неспецифических связывающих скважин. Аккуратно коснитесь боковых сторон пластины, чтобы убедиться, что реагенты хорошо перемешаются. Обложка пластины с уплотнитель пластины, и использовать орбитальный шейкер встряхнуть при комнатной температуре в течение одного часа.
После этого снимите уплотнение пластины, и аспирировать хорошо пластины, мыть каждый хорошо с 300 микролитров мыть буфера четыре раза. Затем высушите тарелку, постукивая ею по чистым абсорбентным полотенцам. Pipette 100 микролитров тетраметилбензидина субстрат для каждой хорошо.
Поместите уплотнитель пластины на хорошо пластины, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого пипетка 50 микролитров стоп-раствора в каждую колодец. Перенесите пластину в считыватель пластин, способный считывать 450 нанометров, и вычислить окончательную концентрацию гормонов, как указано в текстовом протоколе.
В этом исследовании, эссе обнаружения гормонов метаболитов интерес определяется с помощью параллелизма. На кривой параллелизма 50%-ная точка связывания определяет фактор разбавления образца на стандартной кривой. Как видно, 100%этанол и 100%изопропанол экстракты не обеспечивают параллельного перемещения против кортизола стандарта.
Тем не менее, 100% экстракт метанола обеспечивает параллельное смещение против кортизола стандарта. Коэффициенты изменения внутри- и межассай определяются на основе высоко- и низкоопределяющих экстрактов выборки, которые используются во всех анализах. Низкосвязающий внутренний контроль, как видно, аккуратный бассейн экстракт коала, в то время как высокие связывания внутреннего контроля, как видно, один-два разбавленных коала экстракт бассейн.
Связь между каждым экстрактом растворителя и стандартом кортизола определяется с помощью регрессионные участки. Экстракт метанола на 100% обеспечивает лучшую линию регрессии с самым высоким значением R-квадрата по сравнению со 100%-ным этанолом и 100% экстрактами изопропанола. Важно помнить, что шаг мытья образца должны быть выполнены перед шлифовкой образцов, чтобы избежать потери стероидных гормонов.
После этой процедуры, мы можем измерить другие стероидные гормоны, такие как репродуктивные гормоны, чтобы посмотреть на взаимодействие между стрессом и размножения у коал. Этот метод предоставляет новый инструмент для формирующейся области сохранения физиологии, что позволяет неинвазивной оценки кортизола в коала меха. Коммерческий комплект кортизола обеспечивает реагенты в минутном количестве.
Тем не менее, важно носить средства индивидуальной защиты, чтобы свести к минимуму ущерб себе при проведении этой лабораторной процедуры.
