墨西哥的阿斯蒂安娜克斯鱼，也被称为墨西哥的盲洞鱼，正在成为生物科学中各种研究领域的模范有机体，特别是在理解适应性遗传特征的进化方面。这个物种由一个河栖表面形态和一个洞穴居住形态组成，使我们能够分析同一物种的两个种群是如何随着时间而分化的。然而，为了进行这项研究，我们必须能够获得健康的时间匹配的胚胎和杂交交叉。
虽然这种鱼很容易在实验室中保存和繁殖，但鱼主要在夜间产卵，因此在白天获得新鲜出炉的胚胎具有挑战性。在该协议中，我们展示如何通过适应墨西哥的 Astyanax 改变光周期和温度变化，我们能够将育种周期转移到一天中更方便的时间。接下来，我们展示如何识别合适的母鱼，并收集麻醉男性和女性的鱼群。
最后，我们演示了如何使用体外受精产生可行的后代，并讨论成功受精的迹象。我们期望该协议能够使基因构造的注射和发育分析等程序在正常工作时间轻松进行。此外，这种技术可用于在所有洞穴和地表居住种群之间创建混合交叉点。
在包含多排鱼缸的不透明、全封闭的流水养殖系统中设置鱼缸。使用独立的加热元件维护每个油箱的温度，该元件用于在注油过程中手动更改温度。以在各行中启用单独的光点。
在每一行上安装可关闭的门，以防止光线进入或逃逸。自动控制器可以以最少的干扰处理所有光子。在黑暗时间，为机架配备红色工作灯和遮光窗帘，以进行访问。
从一般系统机架中去除所需的鱼，并放在养殖架中，以便于在注水前 14 天调整光期。这使得鱼能够适应新的环境。在此期间，使用安装的水生加热系统，将鱼的温度控制在22.8摄氏度。
正常的光周为六.m至.m，8.m。
到六.m黑暗。对于光循环机架，光周期将移至 10 .m.到 12 .m。
通过调整机架内.m的计时器.m，从下午 12 点到 10 点，请变黑。
一旦鱼被适应，开始为动物产卵。这个过程总共需要六天。在这段时间里，使用已安装的水生加热系统将温度更改为 ova 生产。
第一天，气温从22.8摄氏度升高到24.4摄氏度。第二天，气温从24.4摄氏度升高到26.1摄氏度。在第三天和第四天，气温保持在26.1摄氏度。
鱼将准备在白天产卵，可以进行IVF。第五天，气温从26.1摄氏度降至24.4摄氏度。第六天，气温从24.4摄氏度降至22.8摄氏度。
在重复此温度循环之前，请提供七天的间隔。我们建议继续保持鱼在这个光周期，因为这将减少鱼调整到移动的光周期所需的总时间。首先将湿润的纸巾放入培养皿盖中，然后关闭盘子，以创建一个加湿室，防止在收集过程中使湿纸巾干燥。
接下来选择一名女性进行收集。腹部突出的格雷德鱼可能是这个程序的最佳选择。用冷水固定女性，将她放在湿润的海绵动物支架上。
一旦定位斑点鱼的腹侧与微妙的组织擦拭，因为接触水将导致奥瓦激活。将女性握在拇指和食指之间。轻轻挤压在泌尿孔的侧侧，在泌尿生源开口的方向，同时稍微滚动手指。
使用一次性铲子收集表达的 ova。将这些转移到加湿的培养皿中。如果不需要特定的亲子数据，可以在同一盘中组合几个 ova 离合器。
收集后轻轻地将鱼返回到装满系统水的回收罐中。选择男性进行收集。没有外在可见的男性游戏质量的迹象。
但是，在使用此过程之前，鱼的外观应该看起来健康。用冷水固定雄性，并把他放在一个湿润的海绵动物支架上。用细腻的组织擦拭鱼的腹侧，因为与水的接触会激活密耳。
轻轻地将毛细管的末端放在泌尿生源开口处。用拇指和食指对鱼的两侧施加温和的压力，以排出密耳。开始对向泌尿生源开口移动的刺的异想天开。
收集毛细管末端的密耳。使用吸气管可能需要温和吸气。避免任何可能与密耳一起排出的粪便。
将密耳分配到一个空的1.5毫升离心管中，用两倍于精子延长器E400的体积稀释。继续冰上。如果不需要特定的父级数据，来自多个男性的 Milt 可能会汇集在一起。
此步骤可用于将密耳的工作时间延长数小时，但无需立即施肥。收集后轻轻地将鱼返回到装满系统水的回收罐中。使用新的移液器每个股票混合精子通过移液和/或搅拌管的两侧，然后受精作为精子和密耳，并定居在E400溶液随着时间的推移。
将密耳或扩展的密耳溶液分配到新鲜收集的 ova 中。快速向离合器添加一毫升系统水，以激活精子和卵子进行受精。避免混合或搅拌菜内，并留出两分钟进行受精。
添加E2胚胎培养片，使菜充满2/3。根据随后的程序，胚胎可以马上用于下游应用，也可以在23摄氏度的E2胚胎介质中孵育，直到受精后达到5天。此时，我们使用系统水将胚胎移植到主再循环住房系统。
这种方法的主要优势是可靠的洞穴和表面杂交的阿斯蒂纳克斯墨西哥。传统的混合生产方法是非常具有挑战性的，由于在阿斯蒂纳克斯墨西哥的洞穴形态类型的昼夜节律损失，这导致这些鱼的产卵时间改变。对于在 Astyanax 墨西哥成功IVF手术，收集的卵子的质量是至关重要的。
腹部突出的雌鱼最有可能释放出可行的雌鱼，这种鱼看起来清晰，甚至在外观上。将收集的密耳添加到这种卵子中，通常20到30分钟内即可发育受精胚胎。在进入发育周期的一个细胞阶段之前，可行的胚胎将变得稍微半透明。
未受精的卵子会出现更不均匀和不透明。使用IVF产生特纳贾洞穴鱼和表层鱼的杂交，可以检查广泛的形态表型。例如，表面/洞穴杂交有眼睛指示眼睛的存在是一种主要特征。
然而，在表面洞穴F2杂交，我们得到广泛的眼睛大小范围，表明有多个位置，控制眼睛大小在阿斯蒂安娜克斯墨西哥使它的定量特征。另一个例子是色素沉着。观察表面和洞穴鱼的F1杂交，可以得出结论，身体色素沉着是一个显性特征，因为鱼是完全色素。
在F2一代中，身体色素沉着的变化再次指向一个定量特征。将这种表型数据与测序数据相结合，可以揭示导致这些表型的潜在遗传位点。在该协议中，我们学会了如何将阿斯蒂安娜克斯墨西哥的繁殖周期转移到更方便的一天中，并利用体外受精获得健康可行的胚胎。
除了允许与早期胚胎的工作，它也使未来的精子冷冻保存探索。这项技术的标准化加强了阿斯蒂安娜克斯墨西哥作为早期发展和基因研究的模型系统。
