Collezione Gamete e Fecondazione in vitro di Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus, noto anche come pesce grotta messicano cieco, sta emergendo come organismo modello per una varietà di campi di ricerca in scienze biologiche, in particolare nella comprensione dell'evoluzione dei tratti genetici adattivi. Questa specie è costituita da un morfo superficiale che abita il fiume e da un morfo che abita le caverne che ci consente di analizzare come due popolazioni della stessa specie si sono differenziate nel tempo. Tuttavia, affinché questa ricerca possa svolgersi, dobbiamo essere in grado di ottenere embrioni sani e outcross ibridi abbinati al tempo.

Mentre questa specie è facilmente mantenuta e allevata in laboratorio, i pesci depongono le uova principalmente durante le ore notturne rendendo difficile ottenere embrioni appena deposti durante il giorno. In questo protocollo mostriamo come acclimatando Astyanax mexicanus a cicli di luce alterati e variazioni di temperatura siamo in grado di spostare i cicli riproduttivi in un momento più conveniente della giornata. Successivamente, mostriamo come identificare pesci genitori adatti e raccogliere gameti da maschi e femmine anestetizzati.

Infine, dimostriamo come produrre prole vitale usando la fecondazione in vitro e discutiamo i segni di una fecondazione di successo. Ci aspettiamo che questo protocollo consenta di condurre facilmente procedure come l'iniezione di costrutti genetici e l'analisi dello sviluppo durante il normale orario di lavoro. Inoltre questa tecnica può essere utile per creare outcross ibridi tra tutte le popolazioni di grotte e abitazioni di superficie.

All'interno di un sistema di acquacoltura flow-through opaco e completamente chiuso, che contiene più file di serbatoi. Mantenere la temperatura di ogni serbatoio con un elemento riscaldante indipendente che viene utilizzato per modificare manualmente la temperatura durante il processo di adescamento. Impostare singole righe in modo da abilitare fotoperiodi separati in ciascuna di essi.

Installare porte su ogni riga che possono essere chiuse per evitare che la luce entri o fuorievi. Il controller automatizzato può consentire la manipolazione di tutti i fotoperiodi con il minor disturbo al pesce. Dotare il rack di una luce di lavoro rossa e tende oscuranti per l'accesso durante le ore buie.

Rimuovere il pesce desiderato dalle rastrelliere generali del sistema e posizionarsi nei rack di riproduzione per consentire la regolazione del fotoperiodo 14 giorni prima dell'adescamento. Ciò consente al pesce di acclimatarsi a un nuovo ambiente. Mantenere il pesce a 22,8 gradi Celsius durante questo periodo utilizzando il sistema di riscaldamento acquatico installato.

Il fotoperiodo normale è da sei a.m. a otto p.m luce, e otto p.m.

alle sei .m.dark. Per il rack del ciclo leggero spostare il fotoperiodo a 10 p.m. a 12 p.m.

luce, e da 12 p.m. a 10 p.m. scuro regolando il timer che alimenta la luce all'interno del rack.

Una volta che il pesce è acclimatato inizia ad adescare gli animali per la deposizione delle uova. Questa è una procedura che richiede sei giorni in totale. In questo periodo cambiare la temperatura per innescare la produzione di ovuli utilizzando un sistema di riscaldamento acquatico installato.

Il primo giorno aumentare la temperatura da 22,8 gradi Celsius a 24,4 gradi Celsius. Il secondo giorno aumentare la temperatura da 24,4 gradi Celsius a 26,1 gradi Celsius. Il terzo e il quarto giorno mantenere la temperatura a 26,1 gradi Celsius.

I pesci saranno pronti per la deposizione delle uova durante il giorno e la fecondazione in vitro può essere eseguita. Il quinto giorno abbassare la temperatura da 26,1 gradi Celsius a 24,4 gradi Celsius. Il sesto giorno abbassare la temperatura da 24,4 gradi Celsius a 22,8 gradi Celsius.

Fornire un intervallo di sette giorni prima di ripetere questo ciclo di temperatura. Si consiglia di continuare a tenere il pesce in questo fotoperiodo poiché ciò ridurrà il tempo complessivo necessario al pesce per adattarsi al ciclo di luce spostato. Iniziare inserendo una salvietta di tessuto inumidito in un coperchio della piastra di Petri e chiudendo la piastra per creare una camera umidificata e impedire agli ovuli di asciugarsi durante il processo di raccolta.

Quindi scegli una femmina per la raccolta. I pesci gravidi con grandi addome sporgenti saranno probabilmente la scelta migliore per questa procedura. Immobilizzare una femmina usando acqua refrigerata e posizionare la sua posizione supina in un supporto per animali in spugna inumidito.

Una volta posizionato macchiare il lato ventrale del pesce con una delicata salvietta tissutale come contatto con l'acqua causerà l'attivazione degli ovuli. Tenere la femmina tra il pollice e l'indice. Spremere delicatamente contro i lati laterali della cavità celomica nella direzione dell'apertura urogenitale mentre si rotola leggermente il dito.

Raccogliere gli ovuli espressi utilizzando una spatola usa e getta. Trasferire questi sulla piastra di Petri umidificata. Diverse frizioni di ovuli possono essere combinate nello stesso piatto se non sono necessari dati specifici sulla parentela.

Dopo la raccolta riportare delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero pieno di acqua di sistema. Scegli un maschio per la raccolta. Non ci sono segni esteriormente visibili di qualità maschile gamete.

Tuttavia, il pesce dovrebbe apparire sano nell'aspetto prima dell'uso in questa procedura. Immobilizzare un maschio usando acqua refrigerata e posizionarelo in posizione supina in un supporto per animali in spugna inumidito. Asciugare il lato ventrale del pesce con una delicata salvietta tissutale come contatto con l'acqua attiverà il milt.

Posizionare delicatamente l'estremità di un tubo capillare all'apertura urogenitale. Espellere il milt applicando una leggera pressione sui lati del pesce con il pollice e l'indice. Inizia a distale alle branchie spostandoti verso l'apertura urogenitale.

Raccogliere il milt alla fine di un tubo capillare. L'aspirazione delicata può essere necessaria mediante l'uso di un tubo aspiratore. Evitare eventuali feci che possono essere espulse con il milt.

Erogare il milt in un tubo di centrifuga vuoto da 1,5 millilitri e diluire con il doppio del volume dell'estensore di sperma E400. Tieniti sul ghiaccio. Milt di più maschi può essere raggruppato insieme se non sono necessari dati specifici sulla parentela.

Questo passaggio può essere utilizzato per prolungare l'orario di lavoro del milt per diverse ore, ma non è necessario per la fecondazione immediata. Dopo la raccolta riportare delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero pieno di acqua di sistema. Utilizzando una nuova pipetta per ogni stock mescolare lo sperma pipettando e /o agitando i lati del tubo prima di fertilizzare come spermatozoo e milt e depositarsi in soluzione E400 nel tempo.

Distribuire la soluzione di milt o milt estesa negli ovuli appena raccolti. Aggiungere rapidamente un millilitro di acqua di sistema alla frizione per attivare lo sperma e le uova per la fecondazione. Evitare di mescolare o agitare il contenuto del piatto e lasciare due minuti per la fecondazione.

Aggiungere il supporto embrionale E2 per riempire il piatto 2/3 pieno. A seconda della procedura successiva gli embrioni possono essere utilizzati immediatamente per applicazioni a valle o possono essere incubati in mezzi embrionale E2 a 23 gradi Celsius fino a raggiungere i cinque giorni dopo la fecondazione. A questo punto trasferiamo gli embrioni al principale sistema abitativo di ricircolo utilizzando l'acqua del sistema.

Il principale punto di forza di questo metodo è la produzione affidabile di ibridi di caverne e superfici di Astyanax mexicanus. I metodi convenzionali di produzione ibrida sono molto impegnativi a causa della perdita del ritmo circadiano nel morfotipo rupestre dell'Astyanax mexicanus, che si traduce in tempi di deposizione delle uova alterati di questi pesci. Per una procedura di fecondazione in vitro di successo in Astyanax mexicanus la qualità degli ovuli raccolti è di grande importanza.

I pesci femmine gravidi con grandi addome sporgenti hanno maggiori probabilità di rilasciare ovuli vitali, che appaiono chiari e persino nell'aspetto. L'aggiunta della milt raccolta a tali ovuli comporta lo sviluppo di embrioni fecondati di solito entro 20-30 minuti. Gli embrioni vitali diventeranno leggermente più traslucidi prima di entrare nella fase di una cellula del ciclo di sviluppo.

Gli ovuli non fecondati appariranno più irregolari e opachi. Utilizzando la fecondazione in vitro per generare ibridi di pesci grotta tenaja e pesci di superficie si può esaminare una vasta gamma di fenotipi morfologici. Ad esempio, gli ibridi superficie/grotta hanno occhi che indicano che la presenza di occhi è un tratto dominante.

Negli ibridi F2 della grotta superficiale, tuttavia, otteniamo una vasta gamma di dimensioni degli occhi che indicano che ci sono più loci che controllano le dimensioni degli occhi in Astyanax mexicanus rendendolo un tratto quantitativo. Un altro esempio è la pigmentazione. Osservando l'ibrido F1 di superficie e pesci grotta, si può concludere che la pigmentazione del corpo è un tratto dominante in quanto i pesci sono completamente pigmentati.

Nella generazione F2 la variazione della pigmentazione corporea punta nuovamente verso un tratto quantitativo. La combinazione di questi dati fenotipi con dati di sequenziamento può rivelare loci genetici sottostanti responsabili di questi fenotipi. In questo protocollo abbiamo imparato a spostare i cicli riproduttivi dell'Astyanax mexicanus a ore più convenienti della giornata e ad ottenere embrioni sani e vitali utilizzando la fecondazione in vitro.

Oltre a consentire il lavoro con embrioni in fase iniziale, consente anche la futura esplorazione della crioconservazione dello sperma. La standardizzazione di questa tecnica rafforza Astyanax mexicanus come sistema modello per i primi studi di sviluppo e genetici.