また、盲目のメキシコの洞窟魚として知られているアシアナックスメキシカースは、特に適応遺伝的形質の進化を理解する上で、生物科学の様々な研究分野のモデル生物として出現しています。この種は、川に住む表面モーフと洞窟に住むモーフで構成され、同じ種の2つの集団が時間の経過とともにどのように発散するかを分析することができます。しかし、この研究が行われるには、健康的な時間に合った胚とハイブリッドアウトクロスを得ることができる必要があります。
この種は実験室で簡単に維持され、飼育されていますが、魚は主に夜間に産卵するため、昼間に敷設されたての胚を得ることは困難です。このプロトコルでは、アスティアナックスメキシカンスを変化した光周期と温度変化に順応させることによって、繁殖サイクルをより便利な時間帯にシフトできることを示しています。次に、適切な親魚を特定し、麻酔をした男性とメスから配偶子を採取する方法を紹介します。
最後に、体外受精を用いて生存可能な子孫を生み出す方法を実演し、受精の成功の兆しを議論する。このプロトコルは、遺伝子構築物の注入や発達解析などの手順を通常の労働時間中に容易に行うことを可能にすることを期待する。さらに、この手法は、すべての洞窟と表面住居の集団の間にハイブリッドアウトクロスを作成するのに役立ちます。
複数の列のタンクを含む不透明な、完全に囲まれたフロースルー養殖システム内に魚のタンクを設定します。プライミングプロセス中に温度を手動で変更するために使用される独立した発熱体で各タンクの温度を維持します。個々の行を設定して、それぞれの中で別々のフォト期間を有効にします。
ライトが入ったり逃げたりするのを防ぐために、閉じることができる各行にドアを設置します。自動化されたコントローラーは魚に最も少ない妨害とすべての光周期の操作を可能にすることができる。暗い時間帯にアクセスするための赤い作業灯と遮光カーテンをラックに装備します。
一般的なシステムラックから目的の魚を取り除き、プライミングの14日前に光周期の調整を可能にするために、飼育ラックに置きます。これにより、魚は新しい環境に順応することができます。インストールされた水生暖房システムを使用して、この期間中に摂氏22.8度で魚を保ちます。
通常の光周期は6 a..m.から8 p.m光、8 p.mです。
6 a.m.dark.ライトサイクルラックの場合、光周期は10p.mにシフト.mします。
ライト、および12 p.mから10 p.m暗い、ラック内のライトに電力を与えるタイマーを調整することによって。
魚が順応されると、産卵のために動物をプライミングを開始します。これは合計で6日かかる手順です。この時間の間に設置された水生暖房システムを使用して、オバ生産をプライムに温度を変更します。
初日は気温を摂氏22.8度から24.4度に上げます。2日目には、気温を摂氏24.4度から26.1度に上げます。3日目と4日目には、温度を摂氏26.1度に保ちます。
魚は日中に産卵する準備ができて、IVFを行うことができます。5日目は気温を摂氏26.1度から24.4度に下げます。6日目は気温を摂氏24.4度から22.8度に下げます。
この温度サイクルを繰り返す前に、7日間のギャップを提供してください。これは、シフトされた光サイクルに適応するために魚が必要とする全体的な時間を削減するので、この光周期で魚を維持し続けることをお勧めします.まず、湿らせたティッシュワイプをペトリ皿の蓋に挿入し、皿を閉じて加湿したチャンバーを作り、採取プロセス中に卵子が乾燥するのを防ぎます。
次に、コレクションの女性を選択します。大きな突出した腹部を持つグラビッド魚は、おそらくこの手順のための最良の選択になります.冷たい水を使用して女性を固定し、湿らせたスポンジ動物ホルダーで彼女を上の位置に置きます。
一度水との接触として繊細な組織拭きと魚の腹側をブロットを配置すると、卵子が活性化します。親指と人差し指の間に女性を保持します。指をわずかに転がしながら、尿生殖器の開口部の方向に、血中腔の側面を軽く絞ります。
使い捨てヘラを使用して表現された卵子を収集します。加湿したペトリ皿にこれらを移します。特定の親子関係データが必要ない場合、同じ皿の中で、いくつかのクラッチのオバが結合される。
コレクション後、魚をシステムの水で満たされた回収槽にそっと戻します。コレクションの男性を選択します。外見的に見える男性の配質の兆候はありません。
しかし,この手順で使用する前に、魚は外観が正常に表示されるはずです。冷たい水を使用して男性を固定し、湿らせたスポンジ動物ホルダーで彼を上の位置に置きます。水との接触として繊細な組織拭きで魚の腹側をブロットミルト.
尿生殖器の開口部に毛細管の端をそっと置きます。親指と人差し指で魚の側面に穏やかな圧力をかけることで、ミルトを追い出します。泌尿生殖器の開口部に向かって移動するエラに遠位を開始します。
毛細管の端にミルトを集める。穏やかな吸引は、吸引管の使用によって必要とされるかもしれない。ミルトで追放される可能性のある便を避けてください。
ミルトを空の1.5ミリリットル遠心分離管に分配し、精子エクステンダーE400の2倍の量で希釈します。氷の上に置いておきなさい。特定の親子関係のデータが必要ない場合、複数の男性からのミルトが一緒にプールされることがあります。
このステップは、ミルトの労働時間を数時間延長するために使用することができるが、即時受精のために必要とされない。コレクション後、魚をシステムの水で満たされた回収槽にそっと戻します。各ストックに新しいピペットを使用すると、精子やミルトとして受精する前にチューブの側面をピペット化および/または攪拌することによって精子を混ぜ、時間をかけてE400溶液に落ち着きます。
熟した卵にミルトまたは延長ミルト溶液を分配します。すぐに受精のための精子と卵子を活性化するためにクラッチにシステム水の1ミリリットルを追加します。皿の内容物を混ぜたり攪拌したりすることは避け、受精が起こるのに2分かかります。
E2胚培地を加えて、皿2/3をいっぱいにします。その後の手順に応じて、胚は下流の用途にすぐに使用するか、受精後5日に達するまで摂氏23度でE2胚培地にインキュベートすることができる。この時点で、システム水を使用して胚をメイン再循環ハウジングシステムに移します。
この方法の主な強みは、洞窟の信頼性の高い生産とアスティアナックスメキシカンスの表面ハイブリッドです。ハイブリッド生産の従来の方法は、これらの魚の産卵時間の変化をもたらすアスティアナックスメキシカンスの洞窟形態における概日リズムの喪失のために非常に困難です。アスティアナックスメキシコヌスで成功したIVF手順のために、収集された卵子の品質は非常に重要です。
大きな突出した腹部を持つグラビッド雌の魚は、目見た目もはっきりと見える実行可能な卵子を放出する可能性が最も高い。このような卵子に採取したミルトを加えることは、通常20〜30分以内に受精胚の発達をもたらす。生存可能な胚は、発達周期の1つの細胞段階に入る前に、わずかに半透明になる。
未受精卵は、より不均一で不透明に見えます。IVFを使用してテナジャ洞窟魚と表面魚のハイブリッドを生成し、形態素型の広い範囲を調べることができます。例えば、表面/洞窟ハイブリッドは、目の存在が支配的な形質であることを示す目を持っています。
しかし、表面洞窟F2ハイブリッドでは、アスティアナックスメキシカンスで目の大きさを制御する複数の遺伝子座があり、定量的な形質であることを示す幅広い目のサイズを得ています。もう一つの例は、色素沈着です。表面と洞窟魚のF1ハイブリッドを観察すると、魚が完全に色素化されるにつれて、体の色素沈着が支配的な形質であると結論付けることができます。
F2生成では、体色素沈着の変動は再び定量的形質を指している。このフェノミティックデータとシーケンシングデータの組み合わせは、これらの型を担う基礎的な遺伝的遺伝子座を明らかにすることができる。このプロトコルでは、アスティアナックスメキシカンスの繁殖サイクルを一日のより便利な時間にシフトし、体外受精を使用して健康な生存可能な胚を得る方法を学びました。
初期段階の胚との作業を可能にすることに加えて、精子凍結保存の将来の探査も可能にする。この技術の標準化は、初期の発達および遺伝学的研究のためのモデルシステムとしてアスティアナックスメキシカンスを強化する。
