Collection de gamètes et fertilisation in vitro d'Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus, également connu sous le nom de poisson aveugle des cavernes mexicaines, est en train d’émerger comme un organisme modèle pour une variété de domaines de recherche en sciences biologiques, en particulier dans la compréhension de l’évolution des traits génétiques adaptatifs. Cette espèce se compose d’une morphie de surface riverale et d’un morphé caverne permettant d’analyser comment deux populations d’une même espèce ont divergé au fil du temps. Toutefois, pour que cette recherche se déroule, nous devons être en mesure d’obtenir des embryons en bonne santé assortis dans le temps et des croisements hybrides.

Bien que cette espèce soit facilement entretenue et élevée en laboratoire, les poissons frayent principalement pendant la nuit, ce qui rend difficile l’obtention d’embryons fraîchement pondus pendant la journée. Dans ce protocole, nous montrons comment, en acclimatant Astyanax mexicanus à des cycles lumineux modifiés et des changements de température, nous sommes en mesure de déplacer les cycles de reproduction à un moment plus pratique de la journée. Ensuite, nous montrons comment identifier les poissons parentaux appropriés et recueillir les gamètes des mâles et des femelles anesthésiés.

Enfin, nous démontrons comment produire une progéniture viable à l’aide de fécondation in vitro et discutons des signes d’une fécondation réussie. Nous nous attendons à ce que ce protocole permete de mener facilement des procédures telles que l’injection de constructions génétiques et l’analyse du développement pendant les heures normales de travail. En outre, cette technique peut être utile pour créer des croisements hybrides entre toutes les populations de grottes et de surface.

Installer des aquariums dans un système d’aquaculture opaque et entièrement fermé contenant plusieurs rangées de réservoirs. Maintenez la température de chaque réservoir avec un élément de chauffage indépendant qui est utilisé pour modifier manuellement la température pendant le processus d’amorçage. Configurez des lignes individuelles de manière à activer des photopériodes séparées dans chacune d’entre vous.

Installez des portes sur chaque rangée qui peuvent être fermées pour empêcher la lumière d’entrer ou de s’échapper. Le contrôleur automatisé peut permettre la manipulation de toutes les photopériodes avec le moins de perturbations pour le poisson. Équipez le support d’un feu de travail rouge et de rideaux occultants pour y accéder pendant les heures sombres.

Retirer les poissons désirés des grilles du système général et les placer dans des grilles de reproduction pour permettre l’ajustement de la photopériod 14 jours avant l’amorçage. Cela permet aux poissons de s’acclimater à un nouvel environnement. Gardez le poisson à 22,8 degrés Celsius pendant cette période à l’aide du système de chauffage aquatique installé.

La photopériod normale est de six .m à huit p.m, et huit p.m.

à six a.m.dark. Pour le support à cycle léger, déplacez la photopériod .m 22 h à 12 h.m.

lumière, et 12 p.m. à 22 h.m en ajustant la mise à jour qui alimente la lumière à l’intérieur de la grille.

Une fois que les poissons sont acclimatés commencer à amorce les animaux pour le frai. Il s’agit d’une procédure qui prend six jours au total. Au cours de ce temps changer la température pour amorce la production d’ovules à l’aide d’un système de chauffage aquatique installé.

Le premier jour, la température passe de 22,8 degrés Celsius à 24,4 degrés Celsius. Le deuxième jour, la température passe de 24,4 degrés Celsius à 26,1 degrés Celsius. Les troisième et quatrième jours, la température est de 26,1 degrés Celsius.

Les poissons seront prêts à frayer pendant la journée et la FIV peut être effectuée. Le cinquième jour, la température est passé de 26,1 degrés Celsius à 24,4 degrés Celsius. Le sixième jour, la température est passé de 24,4 degrés Celsius à 22,8 degrés Celsius.

Prévoir un intervalle de sept jours avant de répéter ce cycle de température. Nous recommandons de continuer à garder le poisson dans cette photopériod, car cela réduira le temps global nécessaire par le poisson pour s’adapter au cycle de lumière décalé. Commencez par insérer un chiffon de tissu humidifié dans un couvercle de boîte de Petri et fermez le plat pour créer une chambre humidifiée et empêcher les ovules de sécher pendant le processus de collecte.

Choisissez ensuite une femme pour la collection. Les poissons gravids avec de grands abdomens saillants seront probablement le meilleur choix pour cette procédure. Immobiliser une femelle à l’aide d’eau froide et la placer en position supine dans un porte-animaux éponge humidifié.

Une fois positionné tacher le côté ventral du poisson avec un lingette tissulaire délicate que le contact avec l’eau fera les ovules à activer. Maintenez la femelle entre le pouce et l’index. Presser doucement contre les côtés latériels de la cavité coélomique dans le sens de l’ouverture urogène tout en roulant légèrement le doigt.

Recueillir les ovules exprimés à l’aide d’une spatule jetable. Transférez-les dans la boîte de Pétri humidifiée. Plusieurs couvées d’ovules peuvent être combinées dans le même plat si des données de filiation spécifiques ne sont pas nécessaires.

Après la collecte, remettre doucement le poisson dans un réservoir de récupération rempli d’eau du système. Choisissez un mâle pour la collection. Il n’y a aucun signe visible extérieurement de qualité masculine de gamete.

Cependant, les poissons devraient sembler sains en apparence avant d’être utilisés dans cette procédure. Immobiliser un mâle à l’aide d’eau réfrigérée et le placer en position supine dans un porte-animaux éponge humidifié. Éponger le côté ventral du poisson avec un chiffon de tissu délicat que le contact avec l’eau activera le milt.

Placer délicatement l’extrémité d’un tube capillaire à l’ouverture urogène. Expulser le milt en appliquant une légère pression sur les côtés du poisson avec le pouce et l’index. Commencez à distal aux branchies se déplaçant vers l’ouverture urogène.

Recueillir le milt à l’extrémité d’un tube capillaire. L’aspiration douce peut être nécessaire par l’utilisation d’un tube d’aspirateur. Évitez les excréments qui peuvent être expulsés avec le milt.

Distribuez le milt dans un tube de centrifugeuse vide de 1,5 millilitre et diluez avec deux fois le volume de l’extenseur de sperme E400. Restez sur la glace. Milt de plusieurs mâles peuvent être mis en commun si des données de filiation spécifiques ne sont pas nécessaires.

Cette étape peut être utilisée pour prolonger le temps de travail du milt pendant plusieurs heures, mais n’est pas nécessaire pour la fertilisation immédiate. Après la collecte, remettre doucement le poisson dans un réservoir de récupération rempli d’eau du système. L’utilisation d’une nouvelle pipette pour chaque stock mélange le sperme par pipetting et/ou agitant les côtés du tube avant de fertiliser comme sperme et milt et de s’installer dans la solution E400 au fil du temps.

Distribuez la solution milt ou milt étendue dans les ovules fraîchement recueillis. Ajouter rapidement un millilitre d’eau du système à l’embrayage pour activer le sperme et les ovules pour la fécondation. Évitez de mélanger ou d’agiter le contenu du plat et prévoyez deux minutes pour que la fertilisation se produise.

Ajouter les supports embryonnaires E2 pour remplir le plat 2/3 plein. Selon la procédure ultérieure, les embryons peuvent être utilisés immédiatement pour des applications en aval ou ils peuvent être incubés dans des supports embryonnaires E2 à 23 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent cinq jours après la fécondation. À ce stade, nous transférons des embryons au principal système de recirculation du logement à l’aide de l’eau du système.

La principale force de cette méthode est la production fiable d’hybrides de grottes et de surface d’Astyanax mexicanus. Les méthodes conventionnelles de production hybride sont très difficiles en raison de la perte de rythme circadien dans le morphotype rupestre d’Astyanax mexicanus, ce qui entraîne une modification des temps de frai de ces poissons. Pour une procédure de FIV réussie à Astyanax mexicanus, la qualité des ovules collectés est d’une importance majeure.

Les poissons femelles gravids avec de grands abdomens saillants sont les plus susceptibles de libérer des ovules viables, qui semblent clairs et même en apparence. L’ajout du milt recueilli à ces ovules entraîne le développement d’embryons fécondés habituellement dans les 20 à 30 minutes. Les embryons viables deviendront légèrement plus translucides avant d’entrer dans l’étape d’une cellule du cycle développemental.

Les ovules non fécondés semblent plus inégaux et opaques. En utilisant la FIV pour générer des hybrides de ténoja cavefish et de poissons de surface, on peut examiner un large éventail de phénotypes morphologiques. Par exemple, les hybrides surface/grotte ont des yeux indiquant que la présence d’yeux est un trait dominant.

Dans les hybrides F2 grotte de surface cependant, nous obtenons un large éventail de tailles d’yeux indiquant qu’il ya des loci multiples qui contrôlent la taille des yeux dans Astyanax mexicanus ce qui en fait un trait quantitatif. Un autre exemple est la pigmentation. En observant l’hybride F1 de poissons de surface et de poissons des cavernes, on peut conclure que la pigmentation corporelle est un trait dominant car les poissons sont entièrement pigmentés.

Dans la génération F2, la variation de la pigmentation corporelle indique à nouveau un trait quantitatif. La combinaison de ces données phénotypiques avec des données de séquençage peut révéler les loci génétiques sous-jacents responsables de ces phénotypes. Dans ce protocole, nous avons appris à déplacer les cycles de reproduction d’Astyanax mexicanus à des heures plus commodes de la journée, et à obtenir des embryons viables en bonne santé en utilisant la fécondation in vitro.

En plus de permettre le travail avec des embryons à un stade précoce, il permet également l’exploration future de la cryopréservation du sperme. La normalisation de cette technique renforce Astyanax mexicanus en tant que système modèle pour les études développementales et génétiques précoces.