Astyanax mexicanus, также известный как слепая мексиканская пещерная рыба, становится образцом организма для различных областей исследований в биологической науке, в частности, в понимании эволюции адаптивных генетических признаков. Этот вид состоит из речного обитаемого поверхностного морфинга и пещерного морфинга, что позволяет нам анализировать, как две популяции одного и того же вида расходятся с течением времени. Тем не менее, для того, чтобы это исследование состоится, мы должны быть в состоянии получить здоровые время соответствует эмбрионов и гибридных outcrosses.
Хотя этот вид легко поддерживается и разводят в лаборатории рыбы в первую очередь нереста в ночные часы, что делает его сложным для получения свежеуложенных эмбрионов в дневное время. В этом протоколе мы показываем, как, акклиматизируя Astyanax mexicanus к измененным световым циклам и изменениям температуры, мы можем перенести циклы размножения в более удобное время суток. Далее мы покажем, как определить подходящую родительную рыбу и собирать гегеты из анестезированные самцы и самки.
Наконец, мы демонстрируем, как производить жизнеспособное потомство с помощью экстракорпорального оплодотворения и обсуждаем признаки успешного оплодотворения. Мы ожидаем, что этот протокол позволит легко проводить такие процедуры, как инъекция генетических конструкций и анализ развития в обычное рабочее время. Кроме того, этот метод может быть полезен для создания гибридных ауткроссов между всеми пещерными и поверхностными популяциями.
Настройка аквариумов в непрозрачной, полностью закрытой системе аквакультуры, содержащей несколько рядов цистерн. Поддерживайте температуру каждого резервуара с помощью независимого нагревательного элемента, который используется для ручного изменения температуры во время процесса грунтовки. Настройка отдельных строк таким образом, чтобы отдельные фотопериоды в каждом из них.
Установите двери на каждом ряду, которые могут быть закрыты, чтобы предотвратить проникновение света или побег. Автоматизированный контроллер может позволить манипуляции всех фотопериодов с наименьшим нарушением рыбы. Оборудуйте стойку красным светом работы и затемненными шторами для доступа в темное время суток.
Удалите желаемую рыбу из общих стой системы и поместите в стеллажи для разведения, чтобы обеспечить регулировку фотопериод за 14 дней до грунтовки. Это позволяет рыбе акклиматизироваться к новой среде. Держите рыбу на 22,8 градусов по Цельсию в этот период с помощью установленной системы водного отопления.
Нормальный фотопериод составляет от шести .m до восьми .m света, и восемь .m.
до шести .m.темно. Для светового цикла стойка сдвиг фотопериод до 10 .m. до 12 .m.
свет, и 12 .m. до 10 .m. темно, регулируя таймер, который питает свет в стойке.
После акклиматизации рыбы начинают грунтовки животных для нереста. Это процедура, которая занимает в общей сложности шесть дней. За это время изменить температуру до премьер-овы производства с помощью установленной системы водного отопления.
Днем температура повысится с 22,8 градуса по Цельсию до 24,4 градуса по Цельсию. На второй день поднимите температуру с 24,4 градуса по Цельсию до 26,1 градуса по Цельсию. На третий и четвертый день держите температуру на уровне 26,1 градуса по Цельсию.
Рыба будет готова к нересту в течение дня и ЭКО может быть выполнена. На пятый день понижаю температуру с 26,1 градуса по Цельсию до 24,4 градуса по Цельсию. На шестой день понижаю температуру с 24,4 градуса по Цельсию до 22,8 градуса по Цельсию.
Обеспечьте семидневный разрыв перед повторением этого температурного цикла. Мы рекомендуем продолжать держать рыбу в этом фотопериоде, так как это позволит сократить общее время, необходимое рыбе, чтобы приспособиться к сдвинутому световому циклу. Начните с вставки увлажненной ткани протрите в крышку чашки Петри и закройте блюдо, чтобы создать увлажняемую камеру и предотвратить высыхание овы во время процесса сбора.
Далее выберите самку для коллекции. Gravid рыбы с большими выступающими животы, вероятно, будет лучшим выбором для этой процедуры. Обездвижить самку с помощью охлажденной воды и поместить ее в положение на спине в увлажненной губкой животного держателя.
После позиционирования пятно брюшной стороне рыбы с деликатной ткани протрите при контакте с водой вызовет ova активировать. Держите самку между большим и указательным пальцами. Аккуратно сожмите боковые стороны целомной полости в направлении урогенитального отверстия, слегка слегка скатывая палец.
Соберите выраженную ову с помощью одноразового шпателя. Перенесите их на увлажненные чашки Петри. Несколько клатчей ova могут быть объединены в одном блюде, если конкретные данные о происхождении не нужны.
После сбора аккуратно возвращайте рыбу в восстановительный бак, наполненный системной водой. Выберите мужчину для сбора. Внешне видимых признаков мужского качества гоме нет.
Тем не менее, рыба должна появиться здоровым на вид перед использованием в этой процедуре. Обездвижить самца с помощью охлажденной воды и поместить его в положение на спине в увлажненной губкой животного держателя. Пятно брюшной стороне рыбы с деликатной ткани протрите при контакте с водой активирует milt.
Аккуратно поместите конец капиллярной трубки на урогенитальное отверстие. Изгнать milt, применяя мягкое давление по бокам рыбы с большим и указательный пальцы. Начните дисталь к жабры движущихся к урогенитального открытия.
Соберите milt в конце капиллярной трубки. Нежный всасывания может быть необходимо с помощью аспиратора трубки. Избегайте каких-либо фекалий, которые могут быть изгнаны с milt.
Разбей милю в пустую 1,5-миллилитровую центрифугу и разбавляй в два раза объемом удлинители спермы E400. Держись на льду. Milt от нескольких мужчин могут быть объединились, если конкретные данные о происхождении не требуется.
Этот шаг может быть использован для продления рабочего времени milt в течение нескольких часов, но не требуется для немедленного оплодотворения. После сбора аккуратно возвращайте рыбу в восстановительный бак, наполненный системной водой. Используя новую пипетку для каждого запаса смешать сперму путем пипетки и / или агитации сторон трубки перед оплодотворением, как сперма и milt и поселиться в E400 решение с течением времени.
Выпределите milt или расширенный раствор milt в свежесобранный ova. Быстро добавьте один миллилитр системной воды в сцепление, чтобы активировать сперму и яйцеклетки для оплодотворения. Избегайте смешивания или агитации содержимое блюда и позволить две минуты для оплодотворения происходит.
Добавить E2 эмбриона средств массовой информации, чтобы заполнить блюдо 2/3 полной. В зависимости от последующей процедуры эмбрионы могут быть использованы сразу для применения вниз по течению или они могут быть инкубированы в E2 эмбрионов при 23 градусах по Цельсию, пока они не достигнут пяти дней после оплодотворения. На данный момент мы переасываем эмбрионы в основную ре циркулирующую жилищную систему с помощью системной воды.
Основной силой этого метода является надежное производство пещерных и поверхностных гибридов Astyanax mexicanus. Обычные методы гибридного производства являются очень сложными из-за потери циркадного ритма в пещерном морфотипе Astyanax mexicanus, что приводит к изменению времени нереста этих рыб. Для успешной процедуры ЭКО в Astyanax mexicanus качество собранной овы имеет большое значение.
Gravid самки рыбы с большими выступающими животами, скорее всего, освободить жизнеспособных ова, которые появляются ясно и даже по внешнему виду. Добавление собранного милта к такой яйцеклетке приводит к развитию оплодотворенных эмбрионов обычно в течение 20-30 минут. Жизнеспособные эмбрионы станут немного более полупрозрачными перед входом в одноклеточную стадию цикла развития.
Неутверблеемая ова будет казаться более неравномерной и непрозрачной. Используя ЭКО для создания гибридов tenaja пещерных рыб и поверхностных рыб можно изучить широкий спектр морфологических фенотипов. Например, поверхностные/пещерные гибриды имеют глаза, указывающие на то, что присутствие глаз является доминирующей чертой.
В поверхностной пещере F2 гибридов однако, мы получаем широкий спектр размеров глаз, указывающих, что Есть несколько локусов, которые контролируют размер глаз в Astyanax mexicanus, что делает его количественной чертой. Другим примером является пигментация. Наблюдая F1 гибрид поверхности и пещерных рыб, можно сделать вывод, что пигментация тела является доминирующей чертой, как рыба полностью пигментированы.
В поколении F2 изменение пигментации тела снова указывает на количественную черту. Сочетание этих фенотипических данных с данными секвенирования может выявить основные генетические локусы, ответственные за эти фенотипы. В этом протоколе мы узнали, как перенести циклы размножения Astyanax mexicanus в более удобные часы дня, а также получить здоровые жизнеспособные эмбрионы с помощью экстракорпорального оплодотворения.
В дополнение к разрешению работы с эмбрионами на ранних стадиях это также позволяет в будущем исследование криоконсервации спермы. Стандартизация этого метода укрепляет Astyanax mexicanus в качестве образцовой системы для раннего развития и генетических исследований.
