Gamete Collection y Fertilización In Vitro de Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus, también conocido como el pez cueva mexicano ciego, está emergiendo como un organismo modelo para una variedad de campos de investigación en la ciencia biológica, específicamente en la comprensión de la evolución de los rasgos genéticos adaptativos. Esta especie consiste en un morfo de superficie que habita en el río y un morfo que habita en cuevas, lo que nos permite analizar cómo dos poblaciones de la misma especie divergieron con el tiempo. Sin embargo, para que esta investigación se lleve a cabo, debemos ser capaces de obtener embriones sanos que coincidan con el tiempo y cruces híbridos.

Mientras que esta especie es fácilmente mantenida y criada en el laboratorio, los peces desovan principalmente durante las horas nocturnas, lo que dificulta la obtención de embriones recién colocados durante el día. En este protocolo mostramos cómo aclimatando Astyanax mexicanus a ciclos de luz alterados y cambios de temperatura somos capaces de cambiar los ciclos de reproducción a una hora más conveniente del día. A continuación, mostramos cómo identificar peces padres adecuados y recoger gametos de machos y hembras anestesiados.

Por último, demostramos cómo producir descendencia viable utilizando la fertilización in vitro y discutimos signos de fertilización exitosa. Esperamos que este protocolo permita que procedimientos como la inyección de construcciones genéticas y el análisis del desarrollo se lleven a cabo fácilmente durante las horas normales de trabajo. Además, esta técnica puede ser útil para crear cruces híbridos entre todas las poblaciones de cuevas y habitantes de la superficie.

Establecer tanques de peces dentro de un sistema de acuicultura de flujo a través de opaco y totalmente cerrado que contenga múltiples filas de tanques. Mantener la temperatura de cada tanque con un elemento calefactor independiente que se utiliza para alterar manualmente la temperatura durante el proceso de cebado. Configure filas individuales de una manera para habilitar fotoperiodos separados en cada uno.

Instale puertas en cada fila que se puedan cerrar para evitar que la luz entre o escape. El controlador automatizado puede permitir la manipulación de todos los fotoperiodos con la menor perturbación para los peces. Equipe el bastidor con una luz de trabajo roja y cortinas opacas para acceder durante las horas de oscuridad.

Retire los peces deseados de los bastidores generales del sistema y colóquelos en los estantes de cría para permitir el ajuste del fotoperiodo 14 días antes del cebado. Esto permite que los peces se aclimaten a un nuevo entorno. Mantener el pescado a 22,8 grados centígrados durante este período utilizando el sistema de calefacción acuática instalado.

El fotoperiodo normal es de seis .m a ocho p.m luz, y ocho p.m.

a seis a.m.oscuro. Para el bastidor de ciclo de luz, cambie el fotoperiodo a 10 p.m. a 12 p.m.

luz, y 12 p.m. a 10 p.m. oscuro ajustando el temporizador que alimenta la luz dentro del bastidor.

Una vez que los peces están aclimatados comienzan a cebar a los animales para el desove. Este es un procedimiento que toma seis días en total. Durante este tiempo, cambie la temperatura para preparar la producción de óvulos utilizando un sistema de calefacción acuática instalado.

En el primer día subir la temperatura de 22.8 grados Celsius a 24.4 grados Celsius. En el segundo día subir la temperatura de 24.4 grados Celsius a 26.1 grados Celsius. En el tercer y cuarto día mantener la temperatura en 26.1 grados Celsius.

Los peces estarán listos para desovar durante el día y se puede realizar la FIV. En el quinto día bajar la temperatura de 26.1 grados Celsius a 24.4 grados Celsius. En el sexto día bajar la temperatura de 24.4 grados Celsius a 22.8 grados Celsius.

Proporcione un espacio de siete días antes de repetir este ciclo de temperatura. Recomendamos continuar manteniendo el pescado en este fotoperiodo ya que esto reducirá el tiempo total necesario por el pescado para ajustarse al ciclo de luz desplazado. Comience insertando una toallita de tejido humedecido en la tapa de un plato de Petri y cerrando el plato para crear una cámara humidificada y evitar que los óvulos se sequen durante el proceso de recolección.

A continuación, elige una hembra para la colección. Los peces gravíditos con grandes abdomens que sobresalen probablemente serán la mejor opción para este procedimiento. Inmovilizar a una hembra usando agua fría y colocarla en posición supina en un portacontecidos humedecido.

Una vez colocado manchar el lado ventral del pescado con una limpieza de tejido delicado como el contacto con el agua hará que los óvulos se activen. Sostenga la hembra entre el pulgar y el dedo índice. Apriete suavemente contra los lados laterales de la cavidad coelomica en la dirección de la abertura urogenital mientras rueda ligeramente el dedo.

Recoger los óvulos expresados usando una espátula desechable. Transfiera estos al plato petri humidificado. Se pueden combinar varias garras de óvulos en el mismo plato si no se necesitan datos específicos de parentespación.

Después de la recolección, devuelva suavemente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua del sistema. Elige un macho para la colección. No hay signos visibles externamente de la calidad masculina de los gametos.

Sin embargo, los peces deben aparecer sanos en apariencia antes de su uso en este procedimiento. Inmovilizar a un macho usando agua fría y colocarlo en posición supina en un portacontecidos humedecido. Blot el lado ventral del pez con una delicada toallita de tejido como el contacto con el agua activará la milt.

Coloque suavemente el extremo de un tubo capilar en la abertura urogenital. Expulsar el milt aplicando una suave presión en los lados del pescado con el pulgar y el dedo índice. Comience distal a las branquias moviéndose hacia la abertura urogenital.

Recoger el milt en el extremo de un tubo capilar. La succión suave puede ser necesaria mediante el uso de un tubo de aspirador. Evite las heces que puedan ser expulsadas con la milt.

Dispensar el milt en un tubo centrífugo vacío de 1,5 mililitros y diluir con el doble de volumen del extensor de esperma E400. Manténgase en hielo. Milt de varios machos puede agruparse si no se necesitan datos específicos de parentesco.

Este paso se puede utilizar para extender el tiempo de trabajo de la milt durante varias horas, pero no es necesario para la fertilización inmediata. Después de la recolección, devuelva suavemente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua del sistema. El uso de una nueva pipeta para cada caldo mezclar el esperma por pipeteo y / o agitar los lados del tubo antes de fertilizar como esperma y milt y establecerse en solución E400 con el tiempo.

Dispensar la solución de milt o milt extendida en el óvulos recién recogido. Agregue rápidamente un mililitro de agua del sistema al embrague para activar los espermatozoides y los óvulos para la fertilización. Evite mezclar o agitar el contenido del plato y deje que se produzcan dos minutos para la fertilización.

Añadir medios embrionarios E2 para llenar el plato 2/3 lleno. Dependiendo del procedimiento posterior, los embriones pueden utilizarse de inmediato para aplicaciones posteriores o pueden incubarse en medios embrionarios E2 a 23 grados centígrados hasta que lleguen a cinco días después de la fertilización. En este punto, transferimos embriones al sistema principal de la carcasa de recirculación utilizando agua del sistema.

La principal fortaleza de este método es la producción confiable de híbridos de cuevas y superficies de Astyanax mexicanus. Los métodos convencionales de producción híbrida son muy desafiantes debido a la pérdida del ritmo circadiano en el morfotipo de la cueva de Astyanax mexicanus, lo que resulta en tiempos de desove alterados de estos peces. Para un procedimiento exitoso de FIV en Astyanax mexicanus la calidad de los óvulos recogidos es de gran importancia.

Los peces hembra gravidos con grandes abdomens que sobresalen son más propensos a liberar óvulos viables, que parecen claros e incluso en apariencia. La adición de la milt recogida a tales óvulos resulta en el desarrollo de embriones fertilizados generalmente dentro de 20 a 30 minutos. Los embriones viables se volverán un poco más translúcidos antes de entrar en la etapa de una célula del ciclo de desarrollo.

Los óvulos no fetilados aparecerán más desiguales y opacos. El uso de la FIV para generar híbridos de pez cavernícola de tenaja y peces de superficie se puede examinar una amplia gama de fenotipos morfológicos. Por ejemplo, los híbridos de superficie/cueva tienen ojos que indican que la presencia de ojos es un rasgo dominante.

En los híbridos F2 de la cueva de superficie, sin embargo, obtenemos una amplia gama de tamaños de ojos que indican que hay múltiples loci que controlan el tamaño de los ojos en Astyanax mexicanus por lo que es un rasgo cuantitativo. Otro ejemplo es la pigmentación. Observando el híbrido F1 de la superficie y el pez cueva, se puede concluir que la pigmentación corporal es un rasgo dominante ya que los peces están completamente pigmentados.

En la generación F2 la variación en la pigmentación corporal apunta de nuevo hacia un rasgo cuantitativo. La combinación de estos datos fenotípicos con datos de secuenciación puede revelar loci genético subyacente responsable de estos fenotipos. En este protocolo aprendimos a trasladar los ciclos de reproducción de Astyanax mexicanus a horas más convenientes del día, y a obtener embriones viables y saludables utilizando la fertilización in vitro.

Además de permitir el trabajo con embriones en etapa temprana, también permite la exploración futura de la criopreservación de espermatozoides. La estandarización de esta técnica fortalece Astyanax mexicanus como un sistema modelo para el desarrollo temprano y los estudios genéticos.