非洲爪蟾卵母细胞中连接蛋白和连接蛋白的异源表达是分析间隙连接生物物理性质的有力方法。我们技术的主要优点是使用适用于双站点电压钳位的高边电流测量方法。该程序将由我实验室的博士后研究员袁水演示。
一旦70%至80%的卵母细胞落叶，通过轻轻倾斜管来倾倒酶溶液。通过用ND96溶液填充管子，然后倾析溶液来洗涤卵母细胞五次。最后洗涤后，将卵母细胞转移到含有ND96溶液的60毫米培养皿中。
使用干净的玻璃巴斯德移液管挑选大而健康的卵母细胞并将其转移到含有ND96溶液的60毫米培养皿中，并补充有丙酮酸钠和青霉素链霉素。通过将一小块尼龙网粘合到35毫米培养皿的底部来制备卵母细胞注射皿。用补充丙酮酸和青霉素链霉素的ND96溶液填充卵母细胞注射皿约一半。
然后，在培养皿内排放置25至30个卵母细胞。用轻质矿物油向注射微量移液管后填充，然后将其插入注射器的微量移液器支架中。通过移液将cRNA从其中一个储存的等分试样转移到培养皿盖或底部的内表面。
按下注射器控制器中的填充按钮，将cRNA液滴吸入微量移液管的尖端。然后，按下注射按钮注射cRNA。将注射的卵母细胞转移到含有补充丙酮酸和青霉素链霉素的ND96溶液的新培养皿中。
将它们保持在15至18摄氏度的环境室内一至三天。每天通过将卵母细胞转移到新的培养皿中来更换溶液。使用两个细镊子轻轻剥离包裹卵母细胞的透明绒毛膜。
然后，将每孔两个卵母细胞置于含有ND96溶液的卵母细胞配对室中。将差分电压探头和电流电缆连接到模型单元。然后，使用随附的跳线将红色和黑色插座连接到差分电压探头，并将跳线的任一支连接到模型单元中的任一引脚。
将模型单元中的地线连接到放大器接地电路插座的电缆。将 VM 偏移和 VE 偏移旋钮调至膜电压和膜电流表归零。将箝位从关闭切换为快速或慢速，并将增益拨盘顺时针旋转至允许适当电压钳位将放大器的电压电极和浴电极计归零的水平。
运行一个简单的采集协议，其中包含几个电压步骤，以确认膜电压表中显示的电压根据采集协议而变化，并且电压和电流迹线在 Clampex 中正确显示。将含有配对卵母细胞的培养皿放入记录平台的培养皿容器中。选择一对卵母细胞，必要时旋转培养皿，使两个卵母细胞在左右方向上。
通过磁性底座将载物台锁定到位。将参比电极靠近培养皿的边缘朝向用户侧。然后，将参比电极仅连接到两个差分电压探头之一中的黑色插座。
取一对玻璃微量移液器，用钻石划线器掰开一点尖端，然后通过火抛光使尖端边缘光滑。将微量移液器保持在酒精燃烧器的火焰上方，并将其弯曲成距离尖端约一厘米的平滑角度。用ND96溶液将玻璃移液器完全填充，然后将其插入预填充的微电极支架中。
确保系统中没有气泡。将微电极支架的两毫米引脚插入差分电压电极连接线的两毫米插座中。将两毫米插座夹在基于磁性的钳夹器上，并将差分电压电极的尖端对准两个卵母细胞中的一个。
将差分电压电极连接线的一毫米引脚插入同一侧差分电压探头的红色插座中。从玻璃毛细管制备电压和电流电极，并用氯化钾溶液填充它们。然后，将电极插入放大器随附的电极支架中。
将电极降低到浴液中，将VM偏移和VE偏移拨盘转至膜电压和膜电流计零。通过按 VM 电极测试和 VE 电极测试来检查电极电阻。将电流和电压电极插入卵母细胞并观察负膜电位。
接下来，在放大器的箝位部分，确认直流增益处于到位位置。顺时针旋转增益旋钮至允许适当电压箝位的水平，并将箝位开关从关断调至快速。最后，运行采集协议。
这里显示了卵母细胞实验的示意图。负膜电压和正膜电压步骤从负30毫伏的保持膜电压施加到卵母细胞1，而卵母细胞2保持在负30毫伏的恒定膜电压下。经结电压或Vj定义为卵母细胞2的膜电压减去卵母细胞1的膜电压。
代表性图像显示了样品Lj迹线和所得UNC-9同型间隙结的归一化结电导跨结电压关系。示例Lj迹线和由此产生的UNC-7b同型间隙结的归一化Gj-Vj关系如下所示。结果表明，这两种类型的Gj在Vj依赖性IJ失活率，Vj依赖性和残余Gj量方面存在差异.在尝试该过程时，确保差分电压电极系统没有任何气泡并且其尖端对准非常靠近卵母细胞并且电压和电流电极具有大约一微欧姆的电阻非常重要。
我们的技术易于实施。对于那些最近对使用非洲爪蟾卵母细胞研究间隙连接感兴趣的实验室来说，这可能特别感兴趣。
