Xenopus 난모세포에서 코넥신과 이넥신의 이종 발현은 갭 접합의 생물 물리학 적 특성을 분석하기위한 강력한 접근법입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 이중 사이트 전압 클램프에 적합한 하이 사이드 전류 측정 접근 방식을 사용하는 것입니다. 절차는 내 실험실의 박사 후 연구원 인 Yuan Shui가 시연 할 것입니다.
난모세포의 70~80%가 탈지되자마자, 튜브를 부드럽게 기울여 효소 용액을 데칸트한다. 튜브를 ND96 용액으로 채운 다음 용액을 디캔팅하여 난모세포를 다섯 번 세척하십시오. 최종 세척 후, 난모세포를 ND96 용액이 들어있는 60 밀리미터 페트리 접시로 옮긴다.
깨끗한 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 크고 건강해 보이는 난모세포를 피루베이트 나트륨과 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 ND96 용액이 들어있는 60mm 페트리 접시로 옮겨 옮깁니다. 작은 나일론 메쉬 조각을 35mm 페트리 접시의 바닥에 붙여서 난모세포 주입 접시를 준비하십시오. 난모세포 주사 접시를 피루베이트와 페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 ND96 용액으로 대략 반쯤 채운다.
그런 다음 25 ~ 30 개의 난모세포를 Petri 접시 안에 줄지어 놓습니다. 다시 경량 미네랄 오일로 주입 마이크로 피펫을 채우고 인젝터의 마이크로 피펫 홀더에 삽입하십시오. cRNA를 저장된 분취량 중 하나에서 피펫팅에 의해 페트리 접시 덮개 또는 바닥의 내부 표면으로 옮깁니다.
인젝터 컨트롤러의 채우기 버튼을 눌러 cRNA 액적을 마이크로피펫의 팁으로 흡인합니다. 그런 다음 주입 버튼을 눌러 cRNA를 주입하십시오. 주입 된 난모세포를 피루베이트와 페니실린 스트렙토 마이신으로 보충 된 ND96 용액을 함유 한 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.
환경 챔버 내부에 15 ~ 18 °C에서 1 ~ 3 일 동안 보관하십시오. 난모세포를 새로운 페트리 접시로 옮겨 매일 용액을 교체하십시오. 두 개의 미세한 핀셋을 사용하여 난모세포를 감싸는 투명한 빌린 막을 부드럽게 벗겨냅니다.
이어서, 웰 당 두 개의 난모세포를 ND96 용액을 함유하는 난모세포 페어링 챔버에 놓는다. 차동 전압 프로브와 전류 케이블을 모델 셀에 연결합니다. 그런 다음 빨간색과 검은색 소켓을 포함된 점퍼를 사용하여 차동 전압 프로브에 연결하고 점퍼의 양쪽 레그를 모델 셀의 어느 핀에 연결합니다.
모델 셀의 접지선을 증폭기의 접지 회로 소켓에서 케이블에 연결합니다. VM 오프셋 및 VE 오프셋 노브를 돌려 멤브레인 전압 및 멤브레인 전류 미터를 제로로 만듭니다. 클램프를 끄기에서 빠르거나 느리게 전환하고 게인 다이얼을 시계 방향으로 돌려 적절한 전압 클램프가 증폭기의 전압 전극 및 배스 전극 미터를 제로로 만들 수 있는 수준으로 돌립니다.
몇 가지 전압 단계를 포함하는 간단한 수집 프로토콜을 실행하여 멤브레인 전압 미터에 표시된 전압이 수집 프로토콜에 따라 변경되고 전압 및 전류 트레이스가 Clampex에 제대로 표시되는지 확인합니다. 쌍을 이룬 난모세포가 들어있는 페트리 접시를 녹음 플랫폼의 페트리 접시 리셉터클에 넣습니다. 한 쌍의 난모세포를 선택하고 필요한 경우 페트리 접시를 회전시켜 두 난모세포가 왼쪽과 오른쪽 방향이되도록하십시오.
자기 베이스로 스테이지를 제자리에 고정시킵니다. 페트리 접시의 가장자리 근처에 기준 전극을 사용자 쪽으로 놓습니다. 그런 다음 기준 전극을 두 개의 차동 전압 프로브 중 하나만 있는 검은색 소켓에 연결합니다.
한 쌍의 유리 마이크로 피펫을 가져 와서 다이아몬드 스크라이서로 약간의 팁을 떼어 내고 화재 연마로 팁 가장자리를 부드럽게하십시오. 마이크로 피펫을 알코올 버너의 화염 위에 올려 놓고 팁에서 약 한 센티미터 떨어진 곳에서 부드러운 각도로 구부립니다. 다시 유리 피펫을 ND96 용액으로 완전히 채운 다음 미리 채워진 마이크로 전극 홀더에 삽입하십시오.
시스템에 기포가 없는지 확인하십시오. 마이크로 전극 홀더의 두 밀리미터 핀을 차동 전압 전극 연결 와이어의 두 밀리미터 소켓에 삽입합니다. 두 밀리미터 소켓을 자기 기반 클램퍼에 고정하고 차동 전압 전극의 끝을 두 난모세포 중 하나를 향해 조준합니다.
차동 전압 전극 연결 와이어의 한 밀리미터 핀을 같은 면에 있는 차동 전압 프로브의 빨간색 소켓에 삽입합니다. 유리 모세 혈관에서 전압 및 전류 전극을 준비하고 다시 염화칼륨 용액으로 채 웁니다. 그런 다음, 증폭기와 함께 제공된 전극 홀더에 전극을 삽입한다.
전극을 욕조 용액으로 내리고 VM 오프셋 및 VE 오프셋 다이얼을 멤브레인 전압 및 멤브레인 전류 미터를 제로로 전환합니다. VM 전극 테스트 및 VE 전극 테스트를 눌러 전극 저항을 확인합니다. 전류 및 전압 전극을 난모세포에 삽입하고 음의 막 전위를 관찰하십시오.
다음으로, 증폭기의 클램프 섹션에서 DC 이득이 in 위치에 있는지 확인합니다. 게인 노브를 시계 방향으로 돌려 적절한 전압 클램프를 허용하는 수준으로 돌리고 클램프 스위치를 꺼짐에서 빠르게 돌립니다. 마지막으로 획득 프로토콜을 실행합니다.
난모세포 실험의 다이어그램이 여기에 나와 있습니다. 음수 및 포지티브 막 전압 단계는 마이너스 30 밀리볼트의 유지 막 전압에서 난모세포 1에 적용되는 반면, 난모세포 2는 마이너스 30 밀리볼트의 일정한 막 전압으로 유지됩니다. 횡단접합 전압(Vj)은 난모세포 2의 막 전압에서 난모세포 1의 막 전압을 뺀 값으로 정의된다.
대표적인 이미지는 샘플 Lj 트레이스와 UNC-9 동형 갭 접합부의 정규화된 접합 컨덕턴스 트랜스-접합 전압 관계를 보여준다. 샘플 Lj 트레이스 및 UNC-7b 동형적 갭 접합의 결과적인 정규화된 Gj-Vj 관계가 여기에 도시되어 있다. 결과는 이러한 두 가지 유형의 Gjs가 Vj 의존적 Ij 불활성화 속도, Vj 의존성 및 잔류 Gj의 양에서 다르다는 것을 보여줍니다.절차를 시도하는 동안 차동 전압 전극 시스템에 기포가 없으며 팁이 난모세포와 매우 가깝게 겨냥되어 있고 전압 및 전류 전극이 약 하나의 마이크로 옴의 저항을 갖는지 확인하는 것이 매우 중요합니다.
우리의 기술은 구현하기 쉽습니다. 갭 접합을 연구하기 위해 Xenopus 난모세포를 사용하는 데 새로 관심이있는 실험실에 특히 관심이있을 수 있습니다.
