A expressão heterologous de connexinas e innexins em Xenopus oócitos é uma abordagem poderosa para analisar propriedades biofísicas de junções de lacunas. A principal vantagem de nossa técnica é usar uma abordagem de medição de corrente de alta altura que seja apropriada para grampos de tensão dupla no local. O procedimento será demonstrado por Yuan Shui, um pós-doutorando do meu laboratório.
Assim que 70 a 80% dos oócitos são desfoliculados, decante a solução enzimácica inclinando suavemente o tubo. Lave os oócitos cinco vezes preenchendo o tubo com a solução ND96 e, em seguida, decantando a solução. Após a lavagem final, transfira os oócitos para uma placa de Petri de 60 milímetros contendo solução ND96.
Use uma pipeta pasteur de vidro limpo para colher e transferir oócitos grandes e saudáveis para uma placa de Petri de 60 milímetros contendo solução ND96 suplementada com piruvato de sódio e estreptomicina de penicilina. Prepare uma placa de injeção de oócito colando um pequeno pedaço de malha de nylon no fundo de uma placa de Petri de 35 milímetros. Encha o prato de injeção de oócito aproximadamente na metade com a solução ND96 suplementada com piruvato e estreptomicina de penicilina.
Em seguida, coloque 25 a 30 oócitos em fileiras dentro da placa de Petri. Preencha uma micropipette de injeção com óleo mineral leve e insira-a no suporte de micropipette do injetor. Transfira o cRNA de uma das alíquotas armazenadas para a superfície interna de uma tampa de placa de Petri ou fundo por pipetação.
Pressione o botão de preenchimento no controlador do injetor para aspirar a gota de cRNA na ponta da micropipette. Em seguida, pressione o botão de injeção para injetar o cRNA. Transfira os oócitos injetados para uma nova placa de Petri contendo solução ND96 suplementada com piruvato e estreptomicina de penicilina.
Mantenha-os dentro da câmara ambiental a 15 a 18 graus Celsius por um a três dias. Substitua a solução diariamente transferindo os oócitos para uma nova placa de Petri. Use duas pinças finas para descascar suavemente a membrana villina transparente que envolve o oócito.
Em seguida, coloque dois oócitos por poço em uma câmara de pareamento de oócito contendo a solução ND96. Conecte a sonda de tensão diferencial e os cabos atuais à célula modelo. Em seguida, conecte os soquetes vermelho e preto à sonda de tensão diferencial com o jumper incluído e conecte qualquer perna do jumper a cada pino na célula modelo.
Conecte o fio de terra na célula modelo ao cabo da tomada do circuito do amplificador. Gire os botões de deslocamento VM e VE para zerar os medidores de tensão de membrana e corrente de membrana. Mude o grampo para fora para rápido ou lento e gire o mostrador de ganho no sentido horário para um nível que permite que o grampo de tensão adequado a zero o eletrodo de tensão e os medidores de eletrodos de banho do amplificador.
Execute um protocolo de aquisição simples contendo algumas etapas de tensão para confirmar que a tensão exibida no medidor de tensão da membrana muda de acordo com o protocolo de aquisição, e que os traços de tensão e corrente são exibidos corretamente no Clampex. Coloque uma placa de Petri contendo os oócitos emparelhados no recipiente de placa de Petri da plataforma de gravação. Selecione um par de oócitos e gire a placa de Petri, se necessário, de modo que os dois oócitos estejam na direção esquerda e direita.
Bloqueie o estágio em posição por sua base magnética. Coloque um eletrodo de referência perto da borda da placa de Petri em direção ao lado do usuário. Em seguida, conecte o eletrodo de referência ao soquete preto em apenas uma das duas sondas de tensão diferencial.
Pegue um par de micropipettos de vidro, quebre um pouco da ponta com um escriba de diamante, e alise a borda da ponta pelo polimento de fogo. Segure a micropipette acima da chama de um queimador de álcool e dobre-a para um ângulo suave a aproximadamente um centímetro da ponta. Encha a pipeta de vidro completamente com a solução ND96 e, em seguida, insira-a em um suporte de microeletrodos pré-preenchido.
Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes no sistema. Insira o pino de dois milímetros do suporte de microeletroder no soquete de dois milímetros de um fio de conexão de eletrodo de tensão diferencial. Fixar o soquete de dois milímetros em um grampo baseado magneticamente e apontar a ponta do eletrodo de tensão diferencial em direção a um dos dois oócitos.
Insira o pino de um milímetro do fio diferencial de conexão do eletrodo de tensão na tomada vermelha da sonda de tensão diferencial no mesmo lado. Prepare a tensão e os eletrodos de corrente dos capilares de vidro e encorencham-os com solução de cloreto de potássio. Em seguida, insira os eletrodos nos suportes de eletrodos fornecidos com os amplificadores.
Abaixe os eletrodos na solução de banho e gire os mostradores de deslocamento VM e VE para zerar os medidores de tensão de membrana e corrente de membrana. Verifique a resistência ao eletrodo pressionando o teste de eletrodo VM e o teste de eletrodo VE. Insira os eletrodos de corrente e tensão nos oócitos e observe os potenciais negativos da membrana.
Em seguida, na seção de grampo do amplificador, confirme que o ganho de DC está na posição em que está. Gire o botão de ganho no sentido horário para um nível que permita o grampo de tensão adequado e gire o interruptor do grampo de desligado para rápido. Finalmente, execute um protocolo de aquisição.
Um diagrama do experimento oócito é mostrado aqui. As etapas de tensão de membrana negativa e positiva são aplicadas ao oócito 1 a partir de uma tensão de membrana de retenção de menos 30 milívolos, enquanto o oócito 2 é mantido em uma tensão de membrana constante de menos 30 milvolts. A tensão trans-juncional, ou Vj, é definida como a tensão de membrana do oócito 2 menos a tensão de membrana do oócito 1.
As imagens representativas mostram os traços de Lj da amostra e a consequente relação de tensão trans-juncional de condução trans-juncional da UNC-9. Os traços de Lj da amostra e a relação Gj-Vj normalizada resultante das junções homotípicas unc-7b são mostrados aqui. Os resultados mostram que esses dois tipos de Gjs diferem na taxa de inativação do Ij dependente do VJ, dependência de VJ, e a quantidade de Gj residual.Ao tentar o procedimento, é muito importante garantir que o sistema de eletrodo de tensão diferencial não tenha bolhas de ar e sua ponta seja muito próxima ao oócito e a tensão e eletrodos atuais tenham uma resistência de aproximadamente um microohm.
Nossa técnica é fácil de implementar. Pode ser de particular interesse para aqueles laboratórios que estão recentemente interessados em usar oócitos Xenopus para estudar junções de lacunas.
