秀 丽隐杆线虫 感染模型中的遗传免疫研究

这些方案能够研究对微孢子虫的遗传免疫。这里解释的技术可以帮助我们了解免疫力是如何跨代传递的，以及决定后代对微孢子虫免疫力的分子。秀丽隐杆线虫是一种简单且遗传可处理的模型，用于测定遗传的生成时间短。

可用于蠕虫的许多工具可用于揭示代际免疫的分子机制。当感染P0动物时，使用低孢子剂量，不会显着影响父母产生后代的能力。这确保了漂白产生足够的F1动物用于下游实验开始，在计划感染前一天将所需数量的10厘米非种子线虫生长培养基板从4摄氏度移动到室温。

就在感染之前，在微量离心管中以1， 400倍G沉淀约2， 500个同步L1蠕虫，持续30秒。用移液器吸头除去上清液，将蠕虫留在50微升的M9培养基中。向1期蠕虫中加入1毫升10倍大肠杆菌菌株OP50，并将猪笼草孢子加入所需浓度。

作为未感染的对照，制备L1s和OP50的等效管，其M9培养基的体积相当于所使用的孢子制备体积。通过短暂涡旋混合L1蠕虫样品，并将一毫升蠕虫以上的板放在10厘米的非种子线虫生长培养基板上。旋转以确保液体扩散到整个板上。

在干净的柜子中干燥板，关闭盖子10至20分钟，或直到完全干燥，然后在21摄氏度下孵育72小时。感染后72小时，在解剖显微镜下检查板。含有受感染蠕虫的平板应比含有未感染蠕虫的平板含有更少的胚胎。

然后使用一毫升M9培养基将板上的蠕虫洗涤到微量离心管中。如果板上残留许多蠕虫，则通过以1400倍G离心30秒来沉淀蠕虫。除去上清液并进行额外的板洗涤。

在室温下以1400倍G离心30秒，以沉淀蠕虫并用一毫升M9培养基洗涤两次或直到上清液澄清。将其重新悬浮在最终体积的一毫升M9培养基中，并通过移液充分混合。将100微升悬浮蠕虫转移到新管中，漂白剩余的900微升以打开成虫并释放F1胚胎进行测试。

通过修改执行感染。如手稿中所述。感染后72小时，在解剖显微镜下检查板。

与带有引物蠕虫的平板相比，带有幼稚蠕虫的板应更小，并且包含的胚胎更少。然后，通过在M9培养基中使用一毫升0.1%吐温20的微量离心管将它们从板上洗入微量离心管中，开始蠕虫的染色和固定过程。如果板上残留许多蠕虫，则在室温下以1， 400倍G离心30秒，用移液器吸头除去上清液，并进行额外的板洗。

在室温下以1， 400倍G离心30秒对蠕虫进行沉淀后，用一毫升含有0.1%吐温20的M9培养基洗涤两次或直到上清液澄清。除去上清液，加入700微升丙酮，让蠕虫在室温下固定10分钟。在室温下以10， 000倍G沉淀这些固定蠕虫30秒，并洗涤两次含有0.1%吐温20的一毫升磷酸盐缓冲盐水。

准备50毫升DY96工作溶液，将容器包裹在铝箔中，并将其存放在抽屉中以防止暴露在光线下。向蠕虫颗粒中加入500微升DY96工作溶液，在室温下在黑暗中旋转30分钟。在室温下以10， 000倍G离心该反应30秒，以沉淀蠕虫并除去上清液。

然后，加入 15 微升的安装介质，带或不带 DAPI。将这些染色蠕虫的10微升移液到显微镜载玻片上，并在顶部放置盖玻片。要分析安装在载玻片上的DY96染色蠕虫，请使用荧光显微镜的GFP通道进行成像。

要确定蠕虫种群的适应性，请使用5X或10X物镜来测定每种条件下超过100只蠕虫的重力。在感染后72小时，将F1动物固定并用DY96染色以评估微孢子虫耐药性。感染的父母群体和未感染的对照组在感染后72小时固定并用DY96染色以可视化蠕虫胚胎和微孢子。

受感染的动物很小，含有许多微孢子，并且比健康的，未感染的对照组产生更少的胚胎。蠕虫引力评估显示，与受感染动物相比，约95%的未感染动物产生了后代，感染动物小于80%量化显示，约90%的微孢子处理群体被感染，这取决于含有DY96染色孢子的蠕虫数量。对这些固定动物的量化表明，引物蠕虫比幼稚的蠕虫含有更多的胚胎，这表明在面对感染时适应性更强。

斐济ImageJ用于确定个体幼稚和免疫引发的蠕虫的寄生虫负担，这是体内充满荧光N.parisii孢子的百分比。量化显示，来自受感染父母的蠕虫寄生虫负担显着减少。此外，对单个蠕虫大小的计算表明，在面对N.parisii感染时，原始蠕虫比幼稚动物具有显着的生长优势。

成像研究表明，虽然幼稚的动物通常含有多个孢子和几个受感染的细胞，但引物动物的孢子要少得多或没有孢子，通常没有孢子质。如果未启动和准备的F1种群具有相似数量的gravid和受感染动物，请计算每只动物的卵子数量，并使用ImageJ分析受感染组织以找到更细微的差异。虽然直接黄96染色成熟的孢子，但荧光原位杂交可以揭示细胞内的孢子质。

这可以显示引物和未引物蠕虫中受感染细胞的数量。这些技术表明，父母的转录反应可以有助于诱导后代的遗传免疫力。研究人员现在正在研究后代这种免疫力的性质。