乳腺活体亚细胞显微镜检查

首先，将剃光的麻醉鼠标放在加热垫上。用镊子捏住第四个附近的皮肤，然后用锋利的剪刀剪开凸起的皮肤，做一个大约一厘米的中线切口。在腺体周围沿颅部和尾部方向做圆形切口，并小心地将皮肤从腹部剥离。

立即用生理盐水去除任何外源性血液，以避免随后失去光学分辨率。为了尽量减少失血，请用手持式烧灼机密封任何突出的血管。然后用细镊子轻轻梳理表层，去除浅表结缔组织和脂肪组织。

用生理盐水保持暴露的腺体湿润。如果需要，在手术过程中对暴露的腺体进行沐浴，用外源性试剂（例如药理学试剂或细胞器特异性染料）处理腺体。用半透明、灵活的热塑性薄膜保护腹壁。

小心地将鼠标腹部朝下放置在倒置的显微镜载物台上，使皮瓣延伸到中央盖玻片上。用一层薄薄的凝胶保护暴露区域。将后腿和尾巴用胶带粘在舞台上。

然后在皮瓣和体壁之间放置一个由三根胶带棉棒制成的定制缺口垫片，以缓冲腺体免受呼吸和心跳引起的运动伪影的影响。在载物台开口的两端用胶带牢固地粘上塑料盖，以防止皮瓣在成像过程中滑动。在背皮下插入一根留置导管，该导管连接到管子、注射器和泵。

使用常规荧光显微镜，确认皮瓣稳定且血流量充足。对用 BODIPY 665676 标记的 EGFP 细胞或 EGFP 膜小鼠进行常规共聚焦显微镜检查，对用单丹酰戊烷标记的 EGFP 膜小鼠和用单丹酰戊烷标记的 tdTomato 膜小鼠进行双光子显微镜检查。在 EGFP 细胞小鼠中，分泌型上皮细胞的细胞质被 EGFP 明显标记。

同时，用 BODIPY 665676 染色的脂滴显示为圆形荧光体，尤其是朝向顶端表面。延时分析显示 BODIPY 665676染色的脂滴以可变速度从基底区域移动到根尖区域，并在运输过程中相互融合。在 EGFP 膜小鼠中，EGFP 突出了毛细血管和分泌型上皮细胞的质膜，并且在整个细胞质中可以看到 BODIPY 染色的脂滴。

EGFP 膜或 tdTomato 膜小鼠乳腺的双光子显微镜检查允许更全面地研究腺体形态。表面的胶原纤维通过二次谐波的产生在单丹酰戊烷通道中可视化。进一步进入实质，分泌上皮可见基底、外侧和顶端质膜以及单丹酰戊烷染色的脂滴。

中央管腔在肺泡中进一步变得明显。与 EGFP 细胞小鼠中的 EGFP 不同，红色 tdTomato 荧光基团特别适用于标记毛细血管内皮。