Para começar, coloque o rato raspado e anestesiado em uma almofada de aquecimento. Aperte a pele com uma pinça perto do quarto mamilo e corte a pele levantada com uma tesoura afiada para fazer uma incisão na linha média de aproximadamente um centímetro. Faça incisões circulares ao redor da glândula nas direções cranial e caudal e retire cuidadosamente a pele do abdômen.
Remova qualquer sangue exógeno imediatamente com solução salina fisiológica para evitar a perda subsequente de resolução óptica. Para minimizar a perda de sangue, sele todos os vasos sanguíneos proeminentes com um cauterizador portátil. Em seguida, provoque suavemente a camada superficial com uma pinça fina para remover o tecido conjuntivo e adiposo superficial.
Mantenha a glândula exposta úmida com solução salina fisiológica. Se necessário, trate a glândula com agentes exógenos, por exemplo, agentes farmacológicos ou corantes específicos de organelas, banhando as glândulas expostas durante a cirurgia. Proteja a parede abdominal com uma película termoplástica flexível e semitransparente.
Posicione cuidadosamente o mouse com o lado abdominal voltado para baixo em um microscópio invertido stage de modo que a aba da pele se estenda até a lamínula central. Proteja as áreas expostas com uma fina camada de gel. Prenda a perna traseira e a cauda no palco.
Em seguida, coloque um espaçador entalhado feito sob medida, preparado a partir de três palitos de algodão colados entre a aba da pele e a parede do corpo para amortecer a glândula de artefatos de movimento causados pela respiração e batimentos cardíacos. Prenda com fita adesiva uma tampa de plástico em cada extremidade da abertura do estágio para evitar que a aba da pele deslize durante a imagem. Insira um cateter de demora subcutâneo sob a pele dorsal conectado a um tubo, seringa e bomba.
Usando microscopia de fluorescência convencional, confirme se o retalho cutâneo está estável com fluxo sanguíneo adequado. Realize microscopia confocal convencional do camundongo de membrana EGFP cyto ou EGFP marcado com BODIPY 665676 e microscopia de dois fótons do camundongo de membrana EGFP marcado com monodansilpentano e camundongo de membrana tdTomato marcado com monodansilpentano. Em camundongos citologicamente EGFP, o citoplasma das células epiteliais secretoras foi distintamente marcado pelo EGFP.
Ao mesmo tempo, gotículas lipídicas coradas com BODIPY 665676 apareceram como corpos fluorescentes redondos, especialmente em direção à superfície apical. A análise de lapso de tempo mostrou que BODIPY 665676 gotículas lipídicas coradas movendo-se das regiões basal para apical em velocidades variáveis e fundindo-se umas com as outras em trânsito. Em camundongos com membrana EGFP, o EGFP destacou as membranas plasmáticas das células epiteliais capilares e secretoras e as gotículas lipídicas coradas com BODIPY eram visíveis em todo o citoplasma.
A microscopia de dois fótons das glândulas mamárias de camundongos com membrana EGFP ou tdTomato permitiu uma pesquisa mais abrangente da morfologia da glândula. As fibras colágenas na superfície são visualizadas no canal do monodansilpentano através da segunda geração harmônica. Mais adiante no parênquima, o epitélio secretor é revelado com membranas plasmáticas basais, laterais e apicais e gotículas lipídicas coradas com monodansilpentano.
O lúmen central torna-se óbvio mais adiante no alvéolo. O fluoróforo tdTomato vermelho foi especialmente útil para rotular o endotélio capilar, ao contrário do EGFP nos camundongos citos EGFP.
