이 프로토콜은 CRISPR을 사용하여 마우스 태반의 시간별 표적 조작을 허용하기 때문에 중요합니다. 이를 통해 연구자들은 임신 중기에서 후기에 특정 유전자 기능을 밝힐 수 있습니다. 마우스 태반 내에서 과발현을 유발하는 유전자 조작은 매우 드뭅니다.
이 기술의 주요 장점은 태반 내에서 다양한 유전자 발현 변화를 허용한다는 것입니다. 예비 용어에 이 기술이 성공하지 못한 경우 낙심하지 마십시오. 이 기술은 도전적이기 때문에 마스터하기 위해 연습하는 데 상당한 시간이 필요합니다.
시작하려면 준비 영역에서 마취를 유지하기 위해 노즈 콘과 함께 마취 된 댐 앙와위를 놓습니다. 댐의 복부를 철저히 면도하십시오. 각막 건조를 방지하려면 댐의 양쪽 눈에 인공 눈물 젤을 바르십시오.
그런 다음 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 포비돈-요오드 용액을 최소 3회 교대로 세척한 다음 70% 에탄올로 포비돈-요오드 용액을 최종 코팅하여 수술 부위를 소독합니다. 준비 후 마취 노즈콘이 있는 댐을 지정된 수술 부위로 옮깁니다. 자궁 개복술의 경우 댐 앙와위를 수술대에 놓고 코 콘을 테이프로 제자리에 고정합니다.
섭씨 45도로 설정된 흡수성 패드 아래에 가열 패드를 놓습니다. 발가락 핀치 역류가 없어 마취 깊이를 확인한 후 집게와 가위를 사용하여 텐트 업 피부를 통해 약 2cm 길이의 정중선 절개를 합니다. 그런 다음 자궁 뿔에서 부드럽게 텐트를 치고 멸균 집게를 사용하여 복막을 통해 수직 절개를하십시오.
양쪽 자궁 뿔을 손가락으로 복부 양쪽을 눌러 마사지합니다. 노출된 자궁을 하복부 위에 놓은 멸균 수술용 커튼 위에 놓고 필요에 따라 따뜻한 멸균 식염수 방울로 촉촉하게 유지합니다. 자궁이 노출되면 조작을 위해 세 쌍의 태반을 선택하십시오.
태반 조작의 위치와 자궁 뿔 내의 배아 조직을 기록하십시오. 대조군 플라스미드의 태반 주입을 위해, 보정된 마이크로피펫을 사용하여 3회 주입을 위해 충분한 양의 적절한 대조군 플라스미드를 로딩한다. 태반으로 측면으로 약 0.5mm 깊이에서 탈락과 접합부 사이의 모든 주사를 수행합니다.
주사 후 전기 천공 직전에 접촉 부위를 멸균 식염수로 코팅하고 식염수를 자궁벽의 세 부위에 정확하게 바르고 스포이드 또는 주사기로 패들을 도포합니다. 주입 후 2분 이내에 전기천공 기계에 부착된 한 쌍의 3mm 패들을 사용하여 전기천공을 수행합니다. CRISPR 통합 효율과 배아의 생존 가능성을 보장하려면 설정을 30볼트, 30밀리초 펄스, 2펄스, 970밀리초 펄스 꺼짐 및 단극으로 조정합니다.
태반의 측면에 있는 자궁벽 위로 전기 천공 패들을 부드럽게 누릅니다. 양극 패들을 주입 부위와 음극 바로 반대편에 놓습니다. electroporation 패들을 제거하기 전에 electroporation 기계의 펄스를 누르고 두 펄스가 완료될 때까지 기다립니다.
그런 다음 앞서 입증된 바와 같이 실험 플라스미드의 태반 주입을 진행합니다. 대조군에 대해 수행된 바와 같이 주입 후 2분 이내에 주입된 3개의 실험적 태반 모두의 전기천공을 수행합니다. 태반 조작이 완료되면 손가락만으로 자궁 뿔을 복강 안으로 부드럽게 마사지하여 자궁 뿔을 직접 조작합니다.
13mm, 3/8 원형 바늘 합금으로 45cm 길이의 코팅 및 편조 용해성 봉합사를 사용하여 복막층에 중단 봉합을 수행합니다. 복막층을 봉합한 후 복막에 사용되는 것과 동일한 유형의 용해성 봉합사를 사용하여 용해성 봉합사로 피부를 봉합합니다. 봉합이 완료되면 피부의 봉합사에 조직 접착제를 바릅니다.
조직 접착제가 마르면 기화기를 끄고 수술 부위의 댐을 뒷면의 지지 케이지로 옮깁니다. 태반에 일반적인 CRISPR Cas9 대조군 플라스미드와 활성화 대조군 CRISPR 플라스미드 또는 IGF-1 SAM 활성화 플라스미드를 주입하였다. 대표적인 부검 후 이미지는 모든 치료군에서 눈에 띄는 손상이나 표현형 외관의 변화를 나타내지 않았습니다.
조작된 새끼에서 처리되지 않은 배아의 생존율은 평균 79.05%로 감소한 반면, 조작된 배아의 생존율은 평균 55.56%로 유의하게 감소한 반면, 어떤 그룹의 태반 무게에도 큰 차이가 없었다. 가짜 수술과 비교하여 수술 직후 산모의 체중 증가에는 큰 차이가 없었다. 많은 임신한 댐은 수술 후 하루 동안 체중이 약간 감소하거나 변화가 없었으며, 이는 수술 중 및 수술 후 잠시 식사 중단으로 인한 것으로 보입니다.
대부분의 댐은 E14.5에서 중량 증가를 보였지만 때때로 중량 감소가 여전히 관찰되었습니다. qPCR은 대조군 태반에 비해 IGF-1 과발현 태반에서 IGF-1 발현의 현저한 증가를 보여주었다. E14.5 태반의 ELIZA 평가는 대조군 태반에 비해 IGF-1 과발현 태반에서 IGF-1 단백질 수준의 유의한 증가를 보여주었습니다.
녹색 자가형광은 IGF-1 과발현 태반에서만 빨간색 Cas9 표지가 있는 태반 모체 태아 경계면의 하위 영역을 입증했으며, 이는 태반의 세 하위 영역 모두에서 성공적인 CRISPR 통합을 나타냅니다. C2 하이브리드화 표지의 형광은 처리되지 않은 태반으로의 이동 없이 IGF-1 활성화 플라스미드의 혼입을 확인했습니다. 낙엽 및 미로 영역은 Prl8a8 염색으로 표시된 적색 접합 영역을 둘러싸고 식별될 수 있습니다.
태반과 해당 배아의 조작 유형과 위치를 기록하는 것을 잊지 마십시오. 자궁 뿔 내에서 자궁 경부와 배아의 위치를 기록하는 것이 좋습니다. 이 절차에 따라 태반, 배아 및 댐 분석을 수행 할 수 있습니다.
이를 통해 임신, 태반 기능 및 배아 발달에서 태반 특정 역할을 하는 유전자를 더 잘 이해할 수 있습니다.
