这个过程的总体目标，是解释使用西斯铂作为肾毒剂在成年斑马鱼，分析炎症，和细胞死亡在肾脏组织。为了达到这个目的，成年斑马鱼被麻醉和称重注入腹腔中特定剂量的西斯铂。监测死亡率后，肾脏被解剖，细胞被分离为流动细胞测量或固定和解剖，通过荧光TuneL检测分析。
以下程序可以帮助回答肾脏领域的关键问题，使用西斯铂的肾毒性作用作为工具，开发急性肾损伤模型和成年斑马鱼。该模型可用于探索肾脏保护的新治疗目标，并阐明斑马鱼肾再生机制。西斯铂是一种用于治疗各种癌症的化疗剂。
然而，可以很容易地积累在肾脏中，产生细胞死亡，炎症，并降低肾脏功能。cisplatin 的效果取决于剂量，因此您可以根据您的目标降低我们的剂量增加。这里用于分析炎症和细胞死亡的技术并不完全用于传播疾病模型。
斑马鱼的流动细胞学可以帮助以定量的方式阐明动物的炎症状态，而在TUNEL，我们说可以澄清在生理和病理环境中有波托塞细胞的存在。在开始实验之前，通过将库存溶液稀释到每毫升820微克的氯化钠中，准备西斯铂工作解决方案。接下来，麻醉另一条斑马鱼，擦干一些纸巾上多余的水。
将鱼放在秤上称重，注意重量。进行计算，以了解注入的确切体积。要达到每克重量 120 微克的剂量，请使用下一个公式。
将最终剂量除以工作溶液的剂量，并将此数转换为微升剂，乘以 1000，获得 120 微克 cisplatin 的体积。然后，将这个数字乘以鱼的重量，以获得最终的体积被注射。把鱼放在湿海绵上，用一个小杯子来抱住它。
与腹腔侧向上，并填补胰岛素注射器与计算体积的西斯铂。将针头插入腹中线，以浅角，轻轻拉起心室壁，避免穿刺内脏器官。然后注入解决方案。
注射后，将鱼放在鱼缸中以从麻醉中恢复，并等待恢复的迹象，如游泳和适当的运动。在接下来的几天里，每天监测两次鱼。在这个剂量下，西斯铂在头24小时内诱发大约30%的死亡。
使鱼安乐死，用纸巾擦干多余的水。取出头部和内脏后，使用解剖针固定身体壁。将肾脏定位在鱼的后壁，并使用钳子分离肾脏。
将肾脏放在一个六井板中，冷却溶液为1X PBS，2%FBS，并保持冰上。接下来，用一些液体拾取组织，并通过40微米细胞过滤器将其传递，然后用注射器柱塞轻轻搅拌组织。用一个 1 倍 PBS 洗两次， 2% FBS 。
并在50毫升的猎鹰管中收集细胞。然后离心机在 400 G. 小心用移液器拾取超自然人， 然后丢弃它。加入500微升的冷1X PBS重新悬浮细胞，并把它们放在一个5毫升的流动细胞管。
把它们放在冰上取10微升样品，并将其与90微升的三氯苯蓝色混合在埃彭多夫管中。将混合物中的 10 微升添加到 Neobauer 腔室中，并计算显微镜中的细胞。
将细胞取到细胞仪中读取，然后分析选择感兴趣人群的结果。对于这个程序，安乐死鱼和删除内部器官离开肾脏连接到身体。然后，将车身壁固定在软木表面，并将其分阶段放置在固定溶液上。
保持四度过夜。第二天，用细钳解剖肾脏。尽量不要破坏它。
将其放在一个小的培养皿或埃彭多夫管与1X PBS冲洗。更改 PBS 并准备 2%的 agarose，以便在肾脏进行固体处理之前生成肾脏支持基质。丢弃所有剩余的 PBS，慢慢倒出糖。
然后，用细钳定位肾脏，以防止其折叠。让阿加罗斯在室温下凝固。凝固后，使用手术刀在肾脏周围切开阿加罗斯，形成一个小立方体。
将阿加罗斯立方体放在组织学盒中，并将其发送到组织处理中，将组织嵌入石蜡中。石蜡块，我们将削减在五微米厚度部分。去蜡滑梯，并保持他们在蒸馏水中。
准备一个黑暗的孵化室，把湿纸巾放在底部。将幻灯片放在暗室中，并加入蛋白酶 K 以渗透组织。在37摄氏度下孵化30分钟。
在孵育样品时，通过在标签溶液的 450 微升上添加 50 微升酶溶液来准备 TUNEL 反应混合物。并保护免受光线的照射。拿起暗室，用一个1X PBS洗两次切片。
接下来，干燥幻灯片和图恩反应混合物。并在37摄氏度下孵育两个小时。孵化后，用一张 1X PBS 再次清洗此幻灯片。
并添加DAPI的核计数器染色。在室温下孵育五分钟，不受光线照射。用一个 1X PBS 冲洗三次。
然后，用抗褪色亲水介质塑造幻灯片。放置盖子单。用指甲油密封。
在荧光显微镜中可视化样品。在本图中，可以看到 cisplatin 对鱼类生存有剂量反应效应，相比之下，仅注射 0.9% 氯化钠的对照。此图中的红线表示此视频中使用的每克 120 微克的剂量。
这些剂量可以应用于男性和女性，因为没有发现他们之间的统计差异。流动细胞测量允许量化组织中存在的不同细胞。血细胞种群通过大小或前向散射、粒度或大小散射在几条鱼的肾脏中确定。
这样，就可以分离红细胞、淋巴细胞、粒细胞和造血前体中的种群。在这里，目前的门策略选择颗粒细胞，单细胞和MPO阳性细胞允许找到中性粒细胞在肾脏中的数量标记的骨髓醇酶的荧光表达。在这种情况下，西斯铂的注射导致肾脏中性粒细胞百分比的增加。
TUNEL检测允许通过荧光显微镜观察肾脏的组织滑动来检测组织中的凋亡细胞，在某些细胞的细胞核内可以看到凋亡信号，这里为红色。与蓝色 DAPI 中的核污渍形成鲜明对比。Cisplatin 注射增加了肾脏中凋亡细胞的存在，这些细胞可以手动或使用图像软件进行量化。
在这个视频的结尾，你应该能够知道如何注射和调整西斯铂的剂量，以诱导成人斑马鱼急性肾损伤。以及如何为不同目的解剖肾脏。流细胞测量是一个很好的工具，可以帮助您了解不同细胞类型的配置文件，这取决于在您的实验室中具有特拉根克拉夫线。
如果您想使用抗体标记其所有细胞类型，请记住考虑运输线的颜色。TUNEL检测是一个简单的工具，使我们能够检测凋亡细胞和组织，不仅可以通过显微镜分析，而且可以通过流动细胞学进行分析。请记住，在整个过程中始终使用个人防护装备。
