Flow-Sortierung und Exome Sequenzierung der Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein kombiniertes Durchflusszytometrisches Zellsortier- und Low-Input-Bibliothekskonstruktionsprotokoll der nächsten Generation, das für die Herstellung von hochwertigen, exakt exakten Daten aus den Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms (CHL) entwickelt wurde.

Zusammenfassung

Die Hodgkin-Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms sind im Hintergrund von entzündlichen Lymphozyten spärlich verteilt und enthalten typischerweise weniger als 1% der Tumormasse. Material, das aus Massen-Tumor gewonnen wird, enthält den Tumorgehalt in einer für die Charakterisierung unzureichenden Konzentration. Daher wird hier die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit acht Antikörpern sowie Neben- und Vorwärtsstreuung als Verfahren zur schnellen Trennung und Konzentration von hochreinen Tausenden von HRS-Zellen aus dem Tumor für die anschließende Untersuchung beschrieben. Zur gleichen Zeit, weil Standard-Protokolle für Exome-Sequenzierung in der Regel benötigen 100-1000 ng Eingangs-DNA, die oft zu hoch ist, auch mit Flow-Sortierung, bieten wir auch eine optimierte, Low-Input-Bibliothek Bau-Protokoll in der Lage, qualitativ hochwertige Daten von so wenig wie 10 ng Eingangs-DNA. Diese Kombination ist in der Lage, Bibliotheken der nächsten Generation zu produzieren, die für die Hybridisierung von Ganzkörper e geeignet sindXome Köder oder mehr fokussierte Zielpaneele, wie gewünscht. Exome-Sequenzierung der HRS-Zellen, wenn sie mit gesunden intratumoralen T- oder B-Zellen verglichen werden, können somatische Veränderungen, einschließlich Mutationen, Insertionen und Deletionen, und Kopienzahländerungen identifizieren. Diese Erkenntnisse erläutern die Molekularbiologie von HRS-Zellen und können Wege für gezielte Arzneimittelbehandlungen zeigen.

Einleitung

Fortschritte in der Krebsgenomik als Folge der Sequenzierung der nächsten Generation führten zu signifikanten Durchbrüchen bei der Identifizierung von therapeutischen Targets und bei der Prognose für viele hämatologische und nicht-hämatologische Neoplasien. Neue individualisierte Behandlungsstrategien, die auf spezifischen genomischen Veränderungen basieren, werden in vielen Tumortypen schnell eingeführt (in den Referenzen ^{1 , 2} ). Trotz signifikanter Fortschritte bei der Lymphom-Genomik war das Genom der neoplastischen HRS-Zellen im klassischen Hodgkin-Lymphom (CHL) unerklärt. Die Untersuchungen wurden durch die Knappheit von neoplastischen HRS-Zellen in einer reaktiven Mikroumgebung behindert, was es schwierig macht, gereinigte HRS-Zellpopulationen zu isolieren ³ .

Das Verfahren zur Isolierung lebensfähiger HRS-Zellen aus Primärtumoren wurde von Fromm et al. ^{4 ,}Ref "> 5 ^{, 6.} Das Verfahren verwendet einen Acht-Antikörper-Cocktail, bestehend aus CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 und CD64, um HRS-Zellen aus einer CHL-Tumorsuspension eindeutig zu identifizieren Sind in der Lage, mindestens 1000 lebensfähige HRS-Zellen aus frischen oder gefrorenen Zellsuspensionen aus Tumorbiopsien zu isolieren, die aus mindestens 10 ⁷ Zellen bestehen (ca. 10 mg Gewebe). Die Reinheit ist größer als 90% durch Durchflusszytometrieanalyse und wird geschätzt Mindestens 80% durch exome genomische Analyse von zehn aufeinander folgenden Fällen.

Wir haben eine Durchflusszytometrische Zellisolationstechnik verfeinert, die den Prozess stark erleichtert hat, was die schnelle Isolierung von Tausenden von lebensfähigen HRS-Zellen aus primären CHL-Tumoren ermöglicht. Wir haben die Technik verwendet, um zu produzieren, was geglaubt wird, um die erste Voll-Exome-Sequenz der Tumorzellen in primären Fällen von Hodgkin-Lymphom zu sein. Unsere Studien zeigen,E-Durchführbarkeit von hochdurchsatzreichen, genomweiten Studien einzelner CHL-Fälle und haben bereits zur Identifizierung neuartiger genomischer Veränderungen mit dem Potenzial zur Erklärung von Aspekten der CHL-Pathogenese geführt.

Wir haben eine Pipeline weiterentwickelt, um die extrahierte DNA für genetische Untersuchungen mit hohem Durchsatz zu nutzen. Um zuverlässige Ergebnisse von bis zu 1.000 sortierten HRS-Zellen zu erzielen (das Minimum, das aus sequentiellen Fällen erhalten wurde), entwickelten wir ein modifiziertes DNA-Bibliotheks-Konstruktionsverfahren ^{8 der} nächsten Generation, das es uns ermöglichte, die Adapter-Ligationseffizienz zu erhöhen und DNA-Fragment-Bibliotheken zu erzeugen Ohne übermäßige Verstärkung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von routinemäßigen klinischen Proben und den Nachweis von wiederkehrenden Mutationen und chromosomalen Veränderungen ⁷ .

Protokoll

1. Gewebeverarbeitung und Einfrieren

1. Sammeln Sie Lymphknotengewebe in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) und verarbeiten Sie innerhalb von 24 Stunden der Sammlung. Das ausgeschnittene Lymphknotengewebe ⁹ auf eine Petrischale mit 10 ml RPMI mit 2% fötalem Kälberserum (FCS) überführen und mit einer frischen Skalpellklinge fein zerkleinern. Benutzen Sie die Rückseite eines 10-ml-Spritzenkolbens, um das Gewebe weiter zu schleifen / zu dissoziieren.
2. Übertragen Sie die Flüssigkeit auf ein 50-ml-konisches Rohr durch ein 100 μm-Zellsieb. Spülen Sie die Petrischale und den Filter mit zusätzlichen 10 ml RPMI 2% FCS.
3. Erhalten Sie eine Zellzahl mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämocytometer.
   HINWEIS: Im Allgemeinen werden mindestens 2 x 10 ⁷ Zellen von ca. 5 mm ³ CHL-Lymphknotengewebe erwartet. Es wird eine Lebensfähigkeit von über 80% erwartet, kann aber je nach Probe variieren.
4. Spin die Zellen bei 400 xg für 10 min und aspiraDer Überstand. Legen Sie das Röhrchen mit Zellpellets auf Eis.
5. Pre-Chill Einfrieren Medium auf Eis. Die Zellen in kaltem Gefriermedium bei einer Konzentration von 2 x 10 & ^sup7; / ml resuspendieren und durch Pipettieren resuspendieren. Nicht vortexen Inkubation der Suspension auf Eis für 10 min.
6. Aliquot die Probe 1 ml / Kryo-Durchstechflasche (vorgekühlt auf Eis). Übertragen Sie die Durchstechflaschen auf ein -80 ° C Gefrierschrank für 1-2 Tage und übertragen Sie sie wieder auf flüssigen Stickstoff.

2. Vorbereitung von Zellsuspensionen zur Zellsortierung

HINWEIS: Jede Menge von Antikörpern muss mit 10 Millionen Zellen in einem 300 & mgr; l Färbevolumen richtig titriert werden. Periphere Blut kann für alle Antikörper außer CD30 verwendet werden, für die die KMH2-Zelllinie, die in peripheres Blut versetzt ist, für die Titration verwendet werden kann ¹⁰ . Wir beginnen in der Regel mit dem vom Hersteller empfohlenen Volumen an Antikörper und führen zwei zweifache Verdünnungen und eine zweifache Erhöhung (vier Datenpunkte)Für jede Menge der Antikörpertitration. Wenn der Hersteller beispielsweise ein 10-μL-Volumen empfiehlt, führen wir die Titration mit 2, 5, 10 und 20 μl Volumen durch.

1. Wasserbad auf 37 ° C stellen. Vormischung der titrierten Menge an Antikörpern in einer dunklen Glasampulle und Zugabe von PBS + 2% BSA für ein Gesamtcocktailvolumen von 100 μl.
   HINWEIS: Obwohl wir empfehlen, die Antikörper zu titrieren, können die folgenden Volumina als Ausgangspunkt verwendet werden: CD64, 20 μl; CD95, 5 & mgr; l; CD30, 20 & mgr; l; CD & sub5 ;, 10 & mgr; l; CD20, 10 & mgr; l; CD15, 20 & mgr; l; CD40, 5 & mgr; l; Und CD45, 10 & mgr; l.
2. Übertragen Sie die Durchstechflasche aus flüssigem Stickstoff in einen Eisbecher mit Trockeneis, um das Auftauen zu verhindern. Vorwärmen von 50 ml Taumedium, enthaltend RPMI / 20% FCS / DNase (100 μg / ml) in einem 50-ml-Kegelrohr in einem 37 ° C Wasserbad.
3. 45 ml Taumedium auf ein frisches Röhrchen geben und bei 37 ° C aufbewahren. Schnelles Auftauen der Zellen durch Halten einer kryogenen Durchstechflasche in einem 37 ° C WasserschlägerH bis nur ein sehr kleiner gefrorener Teil bleibt.
4. Gießen Sie den Fläschcheninhalt in das Röhrchen mit 45 ml Taumedium. Spülen Sie die leere kryogene Durchstechflasche 2 mal mit 1 ml Tauwassermedium und kombinieren Sie die Spülungen.
5. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 15 min, um DNase-Verdauung und Zell-Re-Äquilibrierung zu ermöglichen. Die Zellen bei 500 xg für 10 min abreiben und den Überstand absaugen.
6. Die Zellen in etwa 200 & mgr; l des zurückgehaltenen Auftaumediums (5 ml) resuspendieren und 2-3 min auf Raumtemperatur äquilibrieren lassen. Die Wiederherstellung von> 70% der gefrorenen lebensfähigen Zellen wird erwartet.
   HINWEIS: Für eine größere Reinheit von sortierten HRS-Zellen, die durch angrenzende T-Zellen routeriert werden können, kann bei diesem Schritt ein Cocktail aus unmarkierten Antikörpern hinzugefügt werden (siehe optionales Protokoll).
7. 100 μl eines Antikörper-Cocktails zugeben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, vor Licht geschützt. Füge 3 ml Sortiermedium hinzu, spinn die Zellen bei 500 xg abFür 10 min, und aspirieren den Überstand.
8. Die Zellen in 1 ml Sortiermedium resuspendieren und auf ein 5 ml Durchflussröhrchen-Sieb geben.
9. Spülen Sie das 50 ml Konusrohr und das Zellsieb mit zusätzlich 1 ml Sortiermedium und legen Sie Zellen auf Eis.

3. (optionales Protokoll) T-Zellen-Rosetten-Blockierung

ANMERKUNG: HRS-Zellen werden durch T-Zellen in Gewebeschnitten und Zellsuspension rolettet, und diese T-Zellen können möglicherweise die sortierte HRS-Fraktion verunreinigen. Diese Wechselwirkungen werden durch CD54 und CD58 auf der HRS-Zellbindung an LFA-1 und CD2 an den T-Zellen ^{4 , 11} vermittelt. Diese Wechselwirkungen können mit unmarkierten Antikörpern gegen diese Adhäsionsmoleküle blockiert werden.

1. Aliquot 100.000 bis 500.000 Zellen in 100 μl RPMI.
2. Inkubieren Sie die Zellsuspension mit unmarkierten Antikörpern gegen CD2, CD54, CD58 und LFA-1 (jeweils 10 μl) auf Eis für 1 Stunde. TDie Zellsuspension kann nun mit fluoreszierenden Antikörpern markiert werden.

4. HRS-, B- und T-Zell-Isolierung mittels Zellsortierung

HINWEIS: Obwohl wir ein spezielles Forschungsauftragsinstrument mit 5 Lasern verwendet haben (siehe Materialkalkulationstabelle), sollte jeder Sortierer mit der Fähigkeit, die im Antikörper-Panel verwendeten Fluorochrome zu detektieren, ausreichend sein. Die Ausführung der folgenden Schritte erfordert eine Vertrautheit mit der Funktion der Software ¹² und eine Grundkenntnis der Zellsortieroperationen. Bitte beachten Sie die Online-Software-Handbuch für detaillierte Anweisungen.

1. Zytometeraufbau:
   1. Schalten Sie den Computer ein und melden Sie sich an. Schalten Sie die BSC- (und BSC-Steckdosen) ein und schalten Sie das Zytometer ein. Warten Sie mindestens 90 s für die interne CPU des Zytometers zu starten, und öffnen Sie dann die Lasersteuerung Software und überprüfen Sie, ob alle Laser eingeschaltet sind. Starten Sie die Cytometer Software ¹³ und melden Sie sich an.
   2. Innerhalb der Cytometer-Software klicken Sie auf "Cytometer → View Configurations". Wenn das Dialogfenster für das Konfigurations-Unterprogramm geöffnet wird, markieren Sie die benutzerdefinierte Konfiguration von 130 μm und klicken Sie auf "set configuration" und "OK". Beenden Sie das Konfigurationsunterprogramm.
   3. Beobachten Sie das Dialogfenster in der Cytometer-Software und klicken Sie auf "CS & T-Einstellungen verwenden". Installieren Sie eine 130-μm-Düse in das Instrument und schalten Sie den Stream ein, indem Sie auf die rote "X" -Taste im Stream-Fenster klicken. Lassen Sie das Gerät mindestens 30 Minuten aufwärmen.
   4. Führen Sie eine Leistungskontrolle des Instruments mit der gewünschten Methode durch (ein Performance-Tracking-Softwaremodul ist im Lieferumfang des hier beschriebenen Sortierers enthalten, siehe Softwarehandbuch (S. 117 - 122) und Referenzstandard (siehe Werkstoffe für den verwendeten Standard Dieses Setup).
      1. Klicken Sie auf "Cytometer → CST", stellen Sie sicher, dass das Feld "Charakterisieren" auf "Chec" gesetzt istK Leistung "im Pulldown-Menü und klicken Sie auf" Ausführen ". Wenn Sie von Software aufgefordert werden, laden Sie ein Röhrchen von Referenzpartikeln auf die Probe und klicken Sie auf" OK ".
      2. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Fertig stellen" und schließen Sie das Softwaremodul. Nachdem die Cytometer-Software die Wiederherstellung des Zytometers abgeschlossen hat, klicken Sie im daraufhin angezeigten Dialogfeld auf "CS & T-Einstellungen verwenden".
   5. Bestimmen Sie die korrekte Drop-Verzögerung mit der automatischen Drop-Delay-Funktion der Cytometer-Software (siehe S. 154 - 161 des Softwarehandbuchs).
      1. Öffnen Sie im "Browser" -Fenster der Cytometer-Software das "Drop Delay" -Experiment, installieren Sie ein Röhrchen von Kalibrierpartikeln auf der Probe und klicken Sie im Fenster "Acquisition Dashboard" auf "Load". Schalten Sie die automatische Stromüberwachung ein, indem Sie im Fenster "Stream" auf die Schaltfläche "Sweet Spot" klicken. Lassen Sie diese Funktion zu allen Zeiten für alle folgenG Schritte.
      2. Schalten Sie die Ablenkplattenspannung ein, indem Sie auf die Schaltfläche "Spannung" im Seitenstromfenster klicken und dann die Testsortierung durch Klicken auf die Schaltfläche "Test sortieren" unmittelbar neben der Schaltfläche "Spannung" aktivieren.
      3. Passen Sie alle Seitenstromeinstellungen auf Null an, mit Ausnahme des linken Seitenstroms. Passen Sie die Einstellung des linken Seitenstroms so an, dass zwei Stream-Spots im Seitenstromfenster sichtbar sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Optischer Filter" und vergewissern Sie sich, dass der linke Seitenstrompunkt in das linke Feld fällt, das im schwarzen Bereich des Seitenstromfensters erscheint.
      4. Passen Sie die linke Seitenstromeinstellung bei Bedarf an. Deaktivieren Sie die Testsortung, indem Sie erneut auf die Schaltfläche "Test sortieren" klicken. Erweitern Sie im Fenster "Browser" das Element "Globale Arbeitsblätter" des Experiments "Drop Delay", indem Sie auf die Schaltfläche "+" klicken.
      5. Doppelklicken Sie auf "Layout_001 sortieren", um das Sortierlayout zu öffnenIon, dass die linke Sortierpopulation "P1" zugeordnet ist, und klicken Sie im Fenster "Layout sortieren" auf "Sortieren". Klicken Sie im Fenster "Layout sortieren" auf "Auto Delay" und dann auf "Run".
      6. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Beenden". Setzen Sie ein Röhrchen aus sterilem deionisiertem Wasser auf die Probenstufe und klicken Sie im Fenster "Acquisition Dashboard" auf "Load". Führen Sie die Röhre von Wasser für mindestens 5 min, um restliche Testpartikel aus dem Instrument zu löschen, bevor Sie fortfahren.
   6. Führen Sie Kompensationskontrollen (mit Kompensationsperlen aus der Materialkalkulationstabelle oder gleichwertig) mit einem eingebauten Kompensationsaufbau in der Sortiersoftware (siehe S. 131 - 137 des Softwarehandbuchs für weitere Details).
      1. Erstellen Sie ein neues Experiment, indem Sie auf "Experiment New Experiment" klicken. Auf der Registerkarte "Parameter" im Fenster "Instrumentenstatus" löschen Sie ggf. unbenutzte Parameter. Klicken Sie auf "Experiment CompensatIonen-Setup Erstellen Kompensationskontrollen. "
      2. Im Fenster "Browser" erweitern Sie die "Compensation Controls" Probe, indem Sie auf das "+" - Zeichen klicken. Führen Sie Kompensationsregelrohre aus, ohne die Daten aufzuzeichnen und ggf. die Detektorspannungen einzustellen (auf der Registerkarte "Parameter" des "Instrumentenstatus" -Fensters), so dass die positiv gefärbten Perlenpopulationen für jedes Fluorochrom zwischen 10.000 und 100.000 liegen Die hellsten in ihrem primären Erkennungskanal.
      3. Notieren Sie die für jeden Parameter benötigten Spannungen für jede Röhre. Markieren Sie die "Ungefärbte Kontrolle" Röhre unter der "Compensation Controls" Probe durch einen einzigen Klick mit der Maus. Laden Sie das ungefärbte Steuerrohr auf die Probenstufe und klicken Sie im Fenster "Acquisition Control" auf "Load".
      4. Manuelles Eingeben der ermittelten Spannungen durch Ausführen einzelner Kompensationsregelungen in die Melderspannungsfelder für alle Parameter undDann klicken Sie im Fenster "Acquisition Control" auf "Record". Führen Sie alle verbleibenden Kompensationskontrollen aus, und erfassen Sie die Daten, ohne die Einstellungen des Detektors zu ändern. Installieren Sie eine Röhre aus sterilem, deionisiertem Wasser für 5 min, um eventuelles Restmaterial aus dem Instrument zu entfernen, bevor Sie fortfahren.
2. HRS-Zellen-Gating:
   1. Erfassen und Aufzeichnen von mindestens 100.000 Ereignissen für das anfängliche Gating bei der Anpassung der Durchflussrate, um 3.000-4.000 Ereignisse / s zu erwerben (siehe Schritt 4.1).
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, zusätzliches Sortiermedium hinzuzufügen, um die Zellen zu verdünnen, wenn die Zellkonzentration zu hoch ist. Stoppen Sie die Akquisition.
   2. Gate-HRS-Zellen unter Verwendung der in Abbildung 1 beschriebenen Schritte
      HINWEIS: In den meisten CHL-Fällen sind zwischen 0,01% und 0,1% der Zellen HRS-Zellen.
3. B- und T-Zell-Gating:
   1. Identifizieren Sie somatische Kontrollen (B- und T-Zellen) durch das Trennen von CD20 und CD5, respe(Gating-Lymphozyten durch CD45 / SSH), gefolgt von CD20 gegenüber CD5 (siehe Abbildung 1 ).
   2. Target-Sammelströme auf Sammelröhrchen in einem vorgekühlten Zwei- oder Vierweg-Sammelgestell. Füllen Sie entweder Durchflussröhren oder 15-ml-Zentrifugenröhrchen mindestens auf halbem Weg mit Sammelmedium.
   3. Zuordnen von HRS- und Kontrollpopulationen zu ordnungsgemäßen Sammelröhren in der Sortierung nach den Anweisungen des Anbieters. Starten Sie die Zellenerfassung neu und starten Sie die Sortierung.
   4. Sammle alle HRS-Zellen und bis zu 1 Million B- und T-Zellen. Target die Sammelströme auf Sammelröhrchen in einem vorgekühlten Vier-Wege- (oder Zwei-Wege-) Sammelgestell.

5. DNA-Extraktion

1. Pellet sammelte Zellen durch Zentrifugation in 1,5 ml konischen Röhrchen bei 3.000 xg für 10 min und resuspend einmal mit 1 ml PBS, um die Zellen zu waschen.
2. Pellet noch einmal bei 3.000 xg für 10 min und entfernen Sie den Überstand; Sei sehr vorsichtig, nicht zu störenDas winzige Pellet
3. Füge 150 μl Lysepuffer (oder ein geeignetes Volumen für den eingesetzten Kit) zu den gewaschenen Zellen hinzu und vermische durch Pipettieren auf und ab.
   HINWEIS: Man kann das Zelllysat bei -70 ° C an dieser Stelle aufbewahren, falls nötig.
4. Konstruieren Sie eine Säulenanordnung, indem Sie die Filtersäule in die Röhre legen und das Lysat aus Schritt 5.5 in die Säule geben. Spin die Montage bei 13.000 xg für 3 min.
5. Entfernen Sie die Minikolonne aus der Baugruppe und entsorgen Sie die Flüssigkeit im Sammelröhrchen. Ersetzen Sie die Minisäule im Sammelrohr.
6. Füge 650 μl Säulenwaschlösung zu jeder Versammlung hinzu. 10 min bei 13000 x g zentrifugieren Die Flüssigkeit aus dem Sammelrohr entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 4 Wäschen.
7. Die Flüssigkeit aus dem Sammelrohr entsorgen und die Säulenmontage wieder zusammenbauen. 2 min bei 13.000 xg zentrifugieren, um die Bindungsmatrix zu trocknen.
8. Übertragen Sie die Minisäule auf ein neues 1,5-ml-Röhrchen und geben Sie 25 μl 10 mM Tris-Cl zuWird für den nachfolgenden Ultraschallschritt oder Nuclease-freies Wasser, das auf 65ºC erwärmt ist, bevorzugt. Inkubieren für 2 min bei Raumtemperatur und zentrifugieren die Anordnung bei 13.000 xg für 1 min. Wiederholen Sie noch einmal mit 25 μl für insgesamt 50 μl.
9. Mischen Sie die DNA-Elution durch Pipettieren auf und ab und quantifizieren Sie mit der Fluorimetrie ¹⁴ .

6. Bibliotheksbau

1. Vorbereitung vor Beginn:
   1. Stellen Sie den Sonicator auf den Wasserspiegel 12, Intensity 5, Cycles / Burst 200 und Temp 7 ein.
   2. Basierend auf der verfügbaren DNA-Menge, die durch Fluorimetrie und auf dem experimentellen Entwurf bestimmt wird, bestimmen Sie die DNA-Menge, die für den Bibliotheksaufbau verwendet werden soll.
      HINWEIS: Denken Sie daran, dass, wenn zu wenig DNA verwendet wird und die Bibliotheksqualität beeinträchtigt ist, es möglicherweise wenig Anwendung für Material gibt, das für Validierungszwecke zurückgelassen wird. Bei minderwertigen Eingangsgrößen je größer die Eingangsmasse, desto höher die compLexity der resultierenden Sequenzierungsbibliothek. Einige Richtlinien für dieses Protokoll sind wie folgt: 10 ng sollte gute Ergebnisse liefern, und 50 ng können als ein grobes Maximum angesehen werden.
   3. Entscheiden Sie sich für den Adapter: legen Sie das Molverhältnis lose auf die Werte in Tabelle 1 ein .
   4. Berechnen Sie die Anzahl der Adapter in der folgenden Weise zu verwenden:
      HINWEIS: Anzahl der Mole der DNA-Eingabe, n
      ich. N = 1,54e-12 ^-12 * Eingangsmasse (in ng) / (mittlere Fragmentgröße)
      Ii. Wenn die mittlere Fragmentgröße 200 bp beträgt, vereinfacht dies:
      N = 7,7e-15 * Eingangsmasse (in ng)
      Anzahl der Maße des Adapters, um ein
      ich. A = n * r
      Volumen des Adapterbestandes zur Verwendung im Adapterligeschritt, v
      ich. V (in μL ) = a / [ 10 ^-12 * Adapter LagerKonzentration (in μM )]
      HINWEIS: Wenn die Adapterkonzentration niedrig ist, um sicherzustellen, dass die erforderliche Adaptermenge enthalten ist, kann die Adapterlösung verwendet werden, um die Reagenzien anstelle von Wasser zu verdünnen.
      Beispiel: Für 100 ng Eingangs-DNA mit einer mittleren Fragmentgröße von 200 bp, für einen gewünschten molaren Adapter: Insert-Verhältnis von 15: 1 und einer Adapter-Stammkonzentration von 2 μM beträgt das empfohlene Adaptervolumen 5,8 μl.
   5. Zuordnen von indexierten Barcodes zu den Samples.
      HINWEIS: Bibliotheken, die zusammen in eine Hybridisierungsreaktion oder eine Spur auf einer Strömungszelle eines Sequenzers zusammengefasst werden, dürfen keine redundanten Indizes enthalten.
2. Bibliotheksbau - DNA-Scherung:
   1. Fügen Sie die volle Menge an DNA hinzu, die an eine Beschallungsröhre verwendet werden soll. Wenn das Volumen der Probe, die die Eingangs-DNA alleine enthält, weniger als 50 & mgr; l beträgt, fügen Sie Buffer EB zu einem 50 & mgr; l Gesamtvolumen hinzu und mischen.
   2. Sonate für 30 s.
   3. Entfernen Sie den Schlauch und führen Sie einen Schnellspin in einer Mini-Zentrifuge gerade genug, um jedes Spray aus dem oberen Teil der Wände des Mikroröhrchens zu sammeln.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.2-6.2.3 für insgesamt sieben 30-s-Sonden-Sessions für insgesamt 210 s Sonication.
      HINWEIS : Fühlen Sie sich frei, mit der Teilung der 210 s in weniger Sitzungen zu experimentieren.
3. Bibliotheksbau - Endreparatur, A-Tailing und Adapterligatur:
   HINWEIS: Vermeiden Sie jede Größenauswahl vor der PCR-Verstärkungsstufe der Bibliothek.
   1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers ¹⁹ für End-Reparatur und A-Tailing nach der Beschallung der Probe DNA.
   2. Nach A-Tailing verwenden Sie in der Reaktion die entsprechende Anzahl von Molen des Adapters (berechnet in Schritt 6.1.3). Kombinieren Sie den Adapter, A-tailed DNA-Fragmente, Enzym und Puffer und inkubieren über Nacht bei 20 ° C für ca. 16 h.
4. LibRary bau - Bibliotheksverstärkung:
   1. Führen Sie eine Perlenreinigung der Adapter-Ligationsreaktion durch. Nach dem Hinzufügen von Perlen zum PCR-Produkt 5 Minuten bei Raumtemperatur warten. Legen Sie es gegen einen magnetischen Ständer und entfernen Sie die Flüssigkeiten, waschen Sie zweimal in 200 μl 80% igem Ethanol, trocknen Sie die Perlen lang genug, um die meisten der Flüssigkeit ohne Übertrocknung zu entfernen, und eluieren Sie die DNA aus den Perlen durch Pipettieren von 25 & mgr; l Nukleasefreies Wasser, wie vorgeschlagen, auf die Perlen, während das Röhrchen an einem magnetischen Stand bleibt.
      HINWEIS: Es kann möglich sein, mit der Konservierung der Perlen in Polyethylenglykol zu experimentieren
      (PEG) bis nach der Verstärkung anstatt sie zu verwerfen, aber dies wurde nicht getestet.
   2. Geben Sie 0,6 μl einer 1: 1000 Verdünnung von grünem Farbstoff pro 50 μl PCR-Mastermix ein. Alternativ verwenden Sie einen Echtzeit-PCR-kompatiblen Farbstoff der Wahl in der entsprechenden Lautstärke für das Gerät.
   3. Programmieren Sie die PCR-Reaktion bei 98 ° C für45 s für die anfängliche Denaturierung, gefolgt von einem Zyklus der Denaturierung, Glühen und Extension bei 98 ° C für 15 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s, oder wählen Sie das entsprechende Programm, wenn eine Alternative verwenden Polymerase-Enzym
      1. Stellen Sie die Maschine so ein, dass sie für jeden Zyklus Fluoreszenzdaten bei 72 ° C einnimmt. Programmieren Sie eine endgültige Verlängerung bei 72 ° C für 1 min, gefolgt von einem Halten bei 4 ° C für eine unbestimmte Zeit. Die PCR-Primer für die Amplifikation der Adapter-ligierten Bibliothek mit Reagenzien in der Ergänzungstabelle sind: Oligo 1, AATGATACGGCGACCACCGAGA und Oligo 2, CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
   4. Verstärken Sie die Bibliothek unter Verwendung der oben beschriebenen PCR-Bedingungen, während Sie die Fluoreszenzintensitätswerte in Echtzeit mit der qPCR-Software beobachten und kurz vor dem Ende der exponentiellen Wachstumsphase stoppen.
   5. Nach der Amplifikation eine Standard-Perlenreinigung durchführen (siehe Schritt 6.4.1) unter Verwendung von 0,8x das Volumen der AmplifikationsreaktionErbte, typischerweise 0,8 x 50 = 40 & mgr; l Perlen. Füge die Perlen zum PCR-Produkt hinzu und warte 5 min bei Raumtemperatur.
   6. Legen Sie es gegen einen Magnetständer und entfernen Sie die Flüssigkeiten, waschen Sie zweimal in 200 μl 80% igem Ethanol, trocknen Sie die Perlen lang genug, um den größten Teil der Flüssigkeit ohne Übertrocknung zu entfernen, und eluieren Sie durch Zugabe von nukleasefreiem Wasser zu den trockenen Perlen.
   7. Quantifizierung der resultierenden DNA mittels Fluorimetrie Visualisierung der Bibliotheksfragmente für Größe; Siehe Abschnitt über Daten-QC-Erwartungen für weitere Details.

7. Exome Hybridisierung

1. Kombinieren Sie vier Bibliotheken mit verschiedenen Adapter-Barcodes.
   HINWEIS: Die Masse durch die Fluorimetrie und die Grße mit dem Gel wird verwendet, um die Molarität zu berechnen, und dann werden die Bibliotheken in äquimolaren Mengen für eine Gesamtmenge von 1.000 ng Masse der gepoolten Bibliothek kombiniert. Es ist am besten, alle tumor-normalen Paare zusammen zu halten, anstatt sie in getrennte Pools zu trennen.
2. Wenden Sie das Exome-Capture-Protokoll an Up class = "xref"> 15 und mache 8 PCR-Zyklen nach dem Capture Cleanup. Andere Möglichkeiten der Erfassungsziele können möglich sein.

8. Multiplex-Sequenzierung

1. Sequenz ein einziges Hybridisierungs-Capture mit vier Multiplex-Bibliotheken auf einer einzigen Spur auf der Sequenzplattform, auf die in der Materialkalkulationstabelle verwiesen wird ¹⁶ .
   HINWEIS: Für fortgeschrittene Anwender, die ihre Ziel-Lesetiefe planen und optimieren möchten, sind alternative Konfigurationen möglich.

9. Analyse (kann mit alternativen Pipeline (n) ersetzt werden, wenn gewünscht)

1. Schnüffeln und kleine Dellen:
   1. Karte Rohdaten zum menschlichen Referenzgenom, UCSC hg19, mit Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ¹⁷ oder einem alternativen Algorithmus der Wahl. Filter oder Markierung liest mit einer Mapping-Qualität Punktzahl unter 20 und PCR Duplikate mit Samtools ¹⁸ oder PicardRef "> 19
   2. Erkennung von somatischen Nukleotidvarianten und kleinen Indellen in HRS-Proben im Vergleich zu den T-Zell-somatischen Kontrollen unter Verwendung von Strelka ²⁰ oder einem Variantenrufer der Wahl. Wenden Sie SnpEff ²¹ an, um die Strelka-Ausgabe zu kommentieren. Falls gewünscht, kontrollieren Sie systematisch Variantenpositionen für Artefakte mit dem Integrierten Genom Viewer (IGV) ^{22 , 23} .
2. Kopienzahl Änderungen:
   1. Berechnen Sie das log-transformierte Verhältnis " ltr " für jedes exome Zielintervall " i " von intrabibliothekale normalisierte Lesezählungen im Tumor gegen die der Normalen in folgender Weise:
      
      HINWEIS: c ist die Anzahl der Lese-Mapping auf ein bestimmtes Capture-Intervall, l ist die gesamte Bibliotheksgröße, t bezeichnet Tumor und n bezeichnet normal.
   2. Filterung von Intervallen mit unzureichender Deckung ( C _t + C _n <100 Liest) zur weiteren Analyse. Durchführung der Pan-Intervall-Segmentierung mit DNAcopy v.1.0 ²⁴ von Bioconductor in R.
      HINWEIS: Betrachten Sie Segmente, bei denen der absolute Wert des mittleren ltr unter 0,5 ist, um kopierneutral zu sein. Verbleibende Segmente können als Kopienzahlgewinne bezeichnet werden, wenn das Vorzeichen des Mittelwerts positiv ist (mit anderen Worten, es gibt deutlich mehr Liest in der Tumorprobe als in der normalen Probe nach der Normalisierung) oder Kopienzahlverluste, wenn das Zeichen Des mittleren ltr ist negativ.

Ergebnisse

Ein Bioanalyzer-Plot sollte nach der Bibliotheksverstärkung und 0,8x Perlenreinigung aufgenommen werden. Man sollte eine "normalähnliche" Verteilung der Fragmentgrößen im gewünschten Bereich sehen (Abbildung 2a ). Abweichungen von dieser Form, wie eine sichtbare "Schulter" in der Kurve, zeigen die Anwesenheit eines Artefakts mit hohem oder niedrigem Molekulargewicht an. Beispielsweise zeigt Fig. ...

Diskussion

Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach der Beherrschung dieser Technik

Diese Arbeit ermöglicht die Exome-Sequenzierung aus Proben, die mindestens 10 ng DNA enthalten. Im klinischen Kontext schließt diese Grenze die meisten Feinnadel-Aspirationsproben aufgrund unzureichender Materialien aus, enthält aber adäquate Kernbiopsien und exzisionsbiopsische Proben. Dies ermöglicht die Erfassung von Daten aus einem größeren Satz von möglichen Samples.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri or Cell Culture Dish (sterile)
RPMI-1640 Media	Roswell Park Memorial Institute
Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated)
Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile
RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month)
scalpel with fresh blade
10 ml syringe (no needle)
Cryogenic vials
50 ml conical centrifuge tubes, force
Centrifuge			capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g
Hepes buffer(1M, cell culture grade)
phosphate buffered saline (PBS)
Pluoronic-F68	Thermo-Fisher	24040-032
DNAase-I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D4527-10KU	store as 5mg/ml in RPMI in -200C
Bovine Serum Albumin (BSA)
Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X))
CD64-FITC (22)	Beckman Coulter, Miami, FL		20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD30-PE (BerH83)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD5-ECD (BL1a)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)	Ebiosciences, San Diego, CA		5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD20-PC7 (B9E9)	Beckman Coulter, Miami, FL		10 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD15-APC (HI98)	BD Biosciences, San Jose, CA		20 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD45 APC-H7 (2D1)	BD Biosciences, San Jose, CA		Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested
CD95-Pacific Blue (DX2)	Life Technologies, Grand Island, NY		5 uL suggested starting volume; Titering is suggested
CD2 (5 μg; clone RPA-2.10)	Biolegend, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
CD54 (10 μg; clone 84H10)	Serotec, Oxford, United Kingdom		For optional protocol; Titering is suggested
CD58 (10 μg; clone TS2/9)	eBioscience, San Diego, CA		For optional protocol; Titering is suggested
LFA-1 (12 μg; clone MHM23)	Novus Biologicals, Littleton, CO		For optional protocol; Titering is suggested
BD CS&T Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop Beads	BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp antibody capture beads	Beckman Coulter, Miami, FL		Compensation Beads
BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers	BD Biosciences, San Jose, CA		any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient
Wizard	Promega	A2360
10 mM Tris-Cl buffer	NA
Qubit dsDNA HS Assay kit	Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 Sonicator	Covaris, Woburn, MA		Alternatives may be substituted
microTUBE	Covaris, Woburn, MA
Low-Throughput Library Preparation Kit	Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK8221
Sybr Green	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9430
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter, Miami, FL
Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ Exome v.3.0	Roche Nimblegen	6465684001
HiSeq	Illumina
TruSeq-style Universal adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq-style index adapter	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq-style PCR primer 1	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		AATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq-style PCR primer 2	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa		CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
Nuclease Free Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA software	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA
BD Flow Tubes	BD Biosciences, San Jose, CA