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Method Article
Hier verwenden wir ein Polyurethan abstimmbaren Nanopore in eine resistive Pulserfassungstechnik integriert Nanoteilchen Oberflächenchemie über die Messung der Partikelgeschwindigkeiten Translokation zu charakterisieren, die verwendet werden können, das Zeta-Potential der einzelnen Nanopartikel zu bestimmen.
Nanopore Technologien, die zusammen als Resistive Pulssensoren (RPS) bekannt ist, werden verwendet, um Proteine, Moleküle und Nanopartikel zu erkennen, zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tunable resistive Pulserkennung (TRPS) ist eine relativ neue Anpassung an RPS, die einen abstimmbaren Poren enthält, die in Echtzeit verändert werden kann. Hier wir TRPS verwenden , um die Translokation Zeiten von DNA-modifizierten Nanopartikel zu überwachen , da sie die abstimmbaren Porenmembran als Funktion der DNA - Konzentration und Struktur (dh einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA) durchqueren.
TRPS basiert auf zwei Ag / AgCl Elektroden durch eine elastomere Porenmembran getrennt, die eine stabile Ionenstrom auf ein angelegtes elektrisches Feld aufbaut. Im Gegensatz zu verschiedenen optisch-basierten Partikelcharakterisierung Technologien können TRPS charakterisieren einzelnen Partikel unter einer Probenpopulation, so dass für multimodale Proben mit Leichtigkeit analysiert werden. Hier zeigen wir, Zetapotentialmessungenüber Partikel Translokation Geschwindigkeiten von bekannten Standards und wenden diese Analyten Translokation mal abzutasten, wodurch sich das Zetapotential dieser Analyten zu messen.
Sowie Mittel zeta Potentialwerte Erfassen werden die Proben alle unter Verwendung eines Partikel-by-Teilchen Perspektive zeigen weitere Informationen auf einer gegebenen Probe durch die Probenpopulation Verteilungen, zum Beispiel. Von solchen, zeigt dieses Verfahren Potential in Sensoranwendungen für beide medizinischen und ökologischen Bereich.
Funktionalisierte Nanopartikel werden immer beliebter als Biosensoren sowohl in medizinischen und ökologischen Bereich. Die Fähigkeit , eine Nanopartikel der Oberflächenchemie, die mit DNA, beispielsweise zu verändern, erweist sich nützlich für die gezielte Arzneimittelverabreichungssysteme 1 und Überwachung DNA-Protein - Wechselwirkungen 2-4. Eine zunehmend verbreitete Nanopartikel Eigenschaft wird in Biotests verwendet und bei der Bereitstellung von Therapeutika ist Superpara 5. Superparamagnetische Partikel (SPPS) sind äußerst nützlich bei der Identifizierung und spezifischen Analyten aus komplexen Mischungen zu entfernen und kann so mit der einfachen Verwendung eines einzigen Magneten tun. Einmal entfernt, kann der Analyt-gebundenen Teilchen charakterisiert und analysiert werden, für den Zweck geeignet.
Frühere Verfahren verwendet zum Nachweis und zur Charakterisierung von Nanoteilchen umfassen optische Techniken, wie beispielsweise dynamische Lichtstreuung (DLS), die auch als Photonenkorrelationsspektroskopie bekannt. Obwohl ein hallogh Durchsatz Technik wird DLS beschränkt zu sein , eine Mittelungs basierte Technik und bei der Analyse von multimodalen Proben ohne die Zugabe von Spezialsoftware, die größeren Teilchen eine viel dominanter Signal, produzieren einige der kleineren Teilchen völlig unbemerkt 6,7 zu verlassen. Particle-by-Teilchen sind Charakterisierungstechniken daher wesentlich günstiger Nanopartikel und funktionalisierte Nanopartikel-Systeme zu analysieren.
RPS basierten Technologien basieren auf ein elektrisches Feld an eine Probe Aufbringen und Überwachen des Transportmechanismus der Partikel durch einen synthetischen oder biologischen Nanopore. Eine relativ neue Nanopartikel - Detektion und Charakterisierung Technik basiert auf RPS ist abstimmbaren Widerstandspulserkennung (TRPS) 16.08. TRPS ist ein Zwei-Elektrodensystem durch ein elastomeres, abstimmbaren Porenmembran getrennt. Abstimmbarer Poren Verfahren ermöglicht Analyten aus einer Reihe von Form 17 und eine Größe über ihre trans zu messPort-Mechanismen durch die Pore. Abstimmbaren Poren wurden zuvor für die Detektion von kleinen Partikeln (70-95 nm Durchmesser) Herstellung vergleichbare Ergebnisse zu anderen Techniken , wie beispielsweise Transmissionselektronenspektroskopie (TEM) 10 verwendet. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wird ein Ionenstrom beobachtet und als Partikel / Moleküle durch die Poren passieren, sie vorübergehend die Poren blockieren, eine Verringerung der Strom zu verursachen, die als "Blockade Ereignis" definiert werden kann. Jede Blockade Ereignis ist repräsentativ für ein einzelnes Teilchen , so dass jedes Teilchen in einer Probe einzeln auf der Blockade Größe basierend charakterisiert werden kann, Δ Halb Maximum und voller Breite, FWHM, sowie andere Blockade Eigenschaften. Analysieren von einzelnen Teilchen, wie sie durch eine Nanopore passieren ist vorteilhaft für die multimodale Proben als TRPS erfolgreich und effektiv eine Reihe unterscheiden von Partikelgrößen amongst eine einzelne Probe. Tunable resistive Pulserfassungs vervollständigt Größe 10, Zetapotential 12,18 und Konzentration 15 Messungen gleichzeitig in einem einzigen Durchlauf und kann daher noch unterscheiden Proben ähnlich, wenn nicht die gleiche Größe durch ihre Oberflächenladung 19; ein Vorteil gegenüber alternativen Sizing-Techniken.
Zeta - Potential ist als das elektrostatische Potential an der Scherebene 20 definiert ist , und wird aus Partikelgeschwindigkeiten berechnet , da sie eine Pore 19 durchqueren. Zeta-Potential-Messungen einzelner Partikel gibt damit einen Einblick in die Translokation Mechanismen und das Verhalten der Nanopartikel-Systemen in Lösung, wertvolle Informationen für die Zukunft von Nanopartikel-Assay-Designs für eine Vielzahl von Anwendungen. Particle-by-Partikelanalyse solcher Art, ermöglicht auch die Verbreitung und Verteilung von Zetapotentialwerte unter einer Stichprobe untersucht werden, um weitere Informationen erlauben on Reaktionskinetik (einzelsträngig zu doppelsträngiger DNA, zum Beispiel) und Partikelstabilitäten in Lösung erreicht werden.
Hier beschreiben wir eine Technik, und charakterisiert Oberflächen sowohl unmodifizierte und DNA-modifizierten SPP erkennt. Das beschriebene Protokoll ist hier anwendbar auf eine Reihe von anorganischen und biologischen Nanopartikel, aber wir demonstrieren das Verfahren DNA-modifizierten Oberflächen aufgrund ihrer breiten Palette von Anwendungen. Die Technik ermöglicht es dem Benutzer, zwischen einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Ziele auf einer Nanopartikeloberfläche zu unterscheiden, basierend auf Partikel Translokation Geschwindigkeiten durch ein Porensystem und somit deren Zeta-Potentiale.
1. Herstellung der Phosphat-gepufferte Saline mit Tween-20 (PBST) Puffer
2. Vorbereitung Carboxylende Polystyrolteilchengröße Standards
3. Vorbereitung Streptavidin beschichtete Teilchen
4. Herstellung von Oligonucleotiden
5. Die Zugabe von Fänger-Sonde (CP) DNA an die Streptavidin beschichtete Teilchen
6. Hybridisierende Complementary DNA an die CP-Teilchen
7. TRPS-Setup
8. Vorbereiten von Beispielen für TRPS Analyse
9. Kalibrieren des Nanopore für Zeta-Analyse
10. eine Probe Lauf
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Prozesse der magnetischen Reinigung und einer TRPS Messung. A) Beispiel für magnetische Reinigung von Probe mit einer Probe ausgehend enthält überschüssige, nicht gebundene Einfang - Sonde DNA. B) trpS Meßbeispiel i) Partikel durch die Nanopore vorbei und ii) Blockade Ereignis von Teilchen vorübergehend verschließe...
Die Berechnung für das Zeta - Potential verwendet , um eine Kalibrierung basierte Methode verwandt von Arjmandi arbeiten et al. 21. Die Dauer der Translokation von Teilchen, wie sie eine Nanopore durchqueren, als eine Funktion der angelegten Spannung gemessen wird, eine mittlere elektrische Feld und Partikelgeschwindigkeiten über die Gesamtheit eines regelmäßigen konischen Pore verwenden. Die elektrophoretische Mobilität ist die Ableitung von 1 / T in Bezug auf die Spannung (wobei T die Da...
ELCJB wird von Izon Science Ltd. unterstützt
Die Autoren danken Izon Science Ltd für ihre Unterstützung. Die Arbeit wurde von der Europäischen Kommission für Forschung (PCIG11-GA-2012-321836 Nano4Bio) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich, UK | P4417 | 1 tablet dissolved in 200 ml deionized water to make buffer solution. |
Tween-20 | Sigma Aldrich, UK | P1379 | 0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant |
Carboxyl polystyrene nanoparticles | Bangs Laboratories, US | CPC200 | Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1 x 1012 particles/ml, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2 x 1019 C/nm2. |
Streptavidin coated nanoparticles | Ademtech, France | 3121 | Batch had binding capacity of 4,352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1 x 1011 particles/ml. |
Biotinylated oligonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]3' |
Standard olignonucleotides | Sigma Aldrich, UK | VC00001 | Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilized powders reconstituted to 100 µM using deionized water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'. |
Izon qNano | Izon Science, NZ | Inherent pressure on system of 47 Pa | |
Izon Variable Pressure Module (VPM) | Izon Science, NZ | Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 100 Pa. | |
Polyurethane nanopore membranes | Izon Science, NZ | NP150 | Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch. |
Magrack 6 | GE Healthcare, UK | 28-9489-64 | |
Sonic Bath | Fisher Scientific, UK | 10692353 | 80 Watts |
Vortexer | IKA, Germany | 0003365000 | |
Rotary Wheel | Labnet International, US | H5500-230 V |
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