Определение дзета-потенциала через наночастицу транслокации через скоростей перестраиваемого нанопор: Использование ДНК-модифицированных частиц, как в примере

Резюме

Здесь мы используем полиуретановые перестраиваемого нанопор интегрированный в резистивном метод импульсного зондирования для характеристики наночастиц химию поверхности с помощью измерения скоростей транслокации частиц, которые могут быть использованы для определения дзета-потенциала отдельных наночастиц.

Аннотация

Нанопор технологии, известные под общим названием резистивные датчики импульсов (RPS), используются для обнаружения, количественного определения и характеристики белков, молекул и наночастиц. Настраиваемый резистивный импульса зондирования (TRPS) является относительно недавним адаптации к ПСТ, который включает в себя перестраиваемый поры, который может быть изменен в режиме реального времени. Здесь мы используем TRPS для контроля времени транслокации наночастиц ДНК-модифицированного , как они проходят перестраиваемый пор мембраны в зависимости от концентрации и структуры ДНК (то есть, одноцепочечную к двухцепочечной ДНК).

TRPS основана на двух электродов Ag / AgCl, разделенных эластомерного порами мембраны, устанавливающей стабильный ионный ток при приложенного электрического поля. В отличие от различных оптических технологий на основе определения свойств частиц, TRPS могут характеризовать отдельные частицы среди выборочной совокупности, что позволяет мультимодальные образцы для анализа с легкостью. Здесь мы покажем, дзета-потенциал измеренияс помощью транслокации частиц скоростей известных стандартов и применить их к образцу аналитов раз транслокация, таким образом, в результате чего измерения дзета-потенциала этих аналитов.

А также приобретение средних значений дзета-потенциал, образцы все измеряют с помощью частиц по-частицы перспективу, проявляющего больше информации о данном образце посредством распределения выборки населения, например. Из таких, этот метод демонстрирует потенциал внутри приложений зондирования для медицинских и экологических областях.

Введение

Функционализированные наночастицы становятся все более популярными в качестве биосенсоров в медицинских и экологических областях. Способность изменять химию поверхности наночастицу, в ДНК, например, оказывается полезным для целевых систем доставки лекарственных средств ¹ и мониторинга ДНК-белковых взаимодействий ^2-4. Все более и более общее свойство наночастиц быть использованы в биопроб и в доставке терапевтических средств является Суперпарамагнетизм ^5. Суперпарамагнитных частиц (SppS) являются чрезвычайно полезными для выявления и устранения конкретных аналитов из сложных смесей и может сделать это с помощью простого использования одного магнита. После удаления, анализируемые переплете частицы могут быть охарактеризованы и проанализированы соответствует своему назначению.

Предыдущие методы, используемые для обнаружения и определения характеристик наночастиц включают в себя оптические методы, такие как динамического рассеяния света (DLS), иначе известный как фотонной корреляционной спектроскопии. Несмотря на то, приветГ.Х. техника пропускная способность , СДО ограничивается будучи метод на основе усреднения и при анализе мультимодальные образцов без добавления специализированного программного обеспечения, более крупные частицы будут производить гораздо более доминирующего сигнала, в результате чего некоторые из более мелких частиц , совершенно незаметно ^6,7. Частица за частицей методы определения характеристик, следовательно, гораздо более благоприятными для анализа наночастиц и функционализованных систем наночастиц.

технологии, основанные RPS основаны вокруг приложения электрического поля к образцу и мониторинга транспортного механизма частиц через синтетического или биологического нанопоры. Относительно недавно обнаружения наночастиц и характеристика методика , основанная на RPS перестраивалось резистивный импульса зондирования (TRPS) ^8-16. TRPS представляет собой систему из двух электродов, разделенных эластомерного перестраиваемые пор мембраны. Метод перестраиваемый пор позволяет аналитов диапазона формы ¹⁷ и размера , чтобы измерить с помощью их трансмеханизмы портов через поры. Перестраиваемые поры использовались ранее для выявления мелких частиц (70-95 нм в диаметре) , производящее сопоставимые результаты с другими методами , например, трансмиссионной электронной спектроскопии (ПЭМ) ^10. При приложении электрического поля, наблюдается ионный ток и, как частицы / молекулы проходят через поры, они временно блокировать поры, что вызывает уменьшение тока, который может быть определен как '' блокада события ». Каждое событие блокада является представителем одной частицы таким образом , что каждая частица в образце можно охарактеризовать по отдельности на основании величины блокаде, А , А полная ширина полувысоте, FWHM, а также другие свойства блокады. Анализируя отдельные частицы, поскольку они проходят через нанопоры выгодно для мультимодальных образцов, как TRPS может успешно и эффективно различать диапазон частиц размером АмонGST одного образца. Настраиваемый чувствительный резистивный импульс завершается размер ^10, дзета - потенциал ^12,18 и концентрации ¹⁵ измерений одновременно в один проход , и поэтому все еще может дифференцировать образцы аналогичных, если не тот же размер , их поверхностным зарядом ^19; преимущество по сравнению с альтернативными методами проклейки.

Дзета - потенциал определяется как электростатический потенциал в плоскости сдвига ^20, и вычисляется из скоростей частиц , когда они проходят поры ^19. Дзета-потенциал измерения отдельных частиц, таким образом, дает понимание механизмов транслокации и поведения систем наночастиц в растворе, ценную информацию для будущего анализа наночастиц конструкций для целого ряда применений. Частица за частицей анализ такой природы позволяет также распространение и распределение дзета-потенциала ценностей среди населения выборки, чтобы изучить, что позволяет получить дополнительную информацию OКинетика реакции N (Однонитевый с двухцепочечной ДНК, например) и стабиль- частиц в растворе, который необходимо достичь.

Здесь мы описываем технику, которая обнаруживает и характеризует как немодифицированные и ДНК-модифицированных поверхностей SPP. Протокол, описанный в настоящем документе, относится к ряду неорганических и биологических наночастиц, но мы продемонстрировать процедуру с использованием ДНК-модифицированных поверхностей из-за их широкого круга применений. Методика позволяет пользователю различать мишени одноцепочечных и двухцепочечной ДНК на поверхности наночастиц, основанный на скорости транслокации частицы через систему пор и таким образом их дзета-потенциалы.

протокол

1. Создание фосфатно-солевом буферном с Tween-20 (PBST), буфер

1. Растворите PBS таблетку (0,01 М фосфатный буфер, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорида натрия, рН 7,4) в 200 мл деионизированной воды (18,2 МОм).
2. Добавляют 100 мкл (0,05 (об / об)%) Tween-20 до 200 мл буферного раствора в качестве поверхностно-активного вещества.

2. Подготовка карбоксильной Полистирол Стандарты Particle

1. Vortex калибровочные частицы в течение 30 секунд перед обработкой ультразвуком в течение 2 мин при 80 Вт, чтобы создать монодисперсность частиц.
2. Развести калибровка частиц 1 в 100 до концентрации 1x10 ¹⁰ частиц / мл в буфере PBST и вихре в течение 30 сек.

3. Подготовка покрытых стрептавидином частицы

1. Вихре частицы в течение 30 сек до обработки ультразвуком в течение 2 мин при 80 Вт для обеспечения монодисперсность.
2. Развести стрептавидина частицы 1 в 100 в буфере PBST к сети переменногоhieve результирующую концентрацию 1х10 ⁹ частиц / мл и вихрь в течение 30 сек.
   Примечание: Типичный объем образца составляет 200 мкл. Например, если исследовать пять концентрации ДНК готовят 1 мл разведенной частиц, покрытых стрептавидином.

4. Подготовка Олигонуклеотиды

1. Развести олигонуклеотиды с деионизированной водой до результирующей концентрации 100 мкМ.

5. Добавление захвата зонда (CP) ДНК с покрытыми стрептавидином частиц

1. До связывания ДНК, воронка стрептавидина частиц (200 мкл объем пробы) в течение 30 секунд, а затем 2 мин при обработке ультразвуком в 80 Вт.
2. На основании связывающей способности, предоставленной поставщиком (4352 пмоль / мг), добавьте соответствующую концентрацию ДНК частиц для полученных концентраций 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 и 210 ДНК нМ.
3. Vortex образцы в течение 10 сек и место на роторном колесе при комнатной температурев течение 30 мин, чтобы позволить ДНК связываться с поверхностью частиц посредством взаимодействия стрептавидин-биотин.
4. После того, как была добавлена ​​ДНК захвата и инкубировали с частицами, покрытых стрептавидином, удалить избыток ДНК в растворе с помощью магнитной сепарации путем размещения образцов на магнитную стойку в течение 30 мин.
5. Удалить супернатант, следя за тем, чтобы не нарушить новообразованный кластер частиц, наиболее близких к магниту, и заменить с тем же объемом новой порцией буфера PBST.

6. гибридизации комплементарных ДНК для СР-частиц

1. Добавьте необходимое количество ДНК-мишени (более при 500 нм), чтобы обеспечить максимально возможную мишень-связывающем была достигнута.
2. Вихревой образцы в течение 10 сек и место на вращающемся колесе при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. После того, как гибридизация завершена, удалить избыток ДНК-мишени с помощью магнитной сепарации путем размещения образцов на магнитную стойку в течение 30 мин.
4. Удалить супернатантТак, чтобы не мешать новообразованной скопление частиц, наиболее близких к магниту, и заменить с тем же объемом новой порцией буфера PBST.
5. Повторите шаги 6.1 до 6.4 для двух повторностей и поместить эти образцы на роторном колесе при комнатной температуре в течение 16 часов, чтобы исследовать раз ДНК-гибридизации.

Установка 7. TRPS

1. Подключите прибор в компьютерную систему с программным обеспечением на месте.
2. Калибровка начального растяжения с помощью циркуля.
   1. Измерьте расстояние между наружной двумя параллельными губками.
   2. Ввод в программное обеспечение, введя растяжение в поле "растягиваться" на вкладке "Настройки инструмента" и нажав "Калибруйте растягиваться" под вкладкой.
3. Сбоку соответствовать полиуретановый нанопор мембраны соответствующего размера для анализа на челюсти с нанопор идентификационный номер вверх. Затем растянуть челюсти на участке, необходимого для анализа с помощьюстрейч регулировка ручки на боковой панели прибора. Stretch челюсти от 43 до 48 мм.
   Примечание: Точное значение перегоне определяется наряду с приложенным напряжением, так что блокад калибровки частиц по меньшей мере, 0,3 нА в размере. Отрезок уже вводится в программу на этапе 7.2 и автоматически отрегулирует как челюсти вытянуты.
4. Поместите 80 мкл буфера PBST в камере ниже жидкости, под нанопор, обеспечивая нет настоящего пузыри, которые могут повлиять на точность измерения. Если есть пузырьки видно, удалить и заменить буфер.
5. Нажмите на верхнюю ячейку жидкости на место и поместите 40 мкл буфера в него, снова обеспечивая нет пузырьков присутствуют. Если имеются пузырьки в верхней камере жидкости, удалите их путем замены жидкости.
6. Когда воспроизводимый базовый ток был достигнут от замены верхней ячейки жидкости с буфером, добавляют 40 мкл образца к верхней ячейке жидкости и измерения, нажав кнопку "улискусство 'в закладке' Сбор данных 'на экране программного обеспечения.
   Примечание: Сбор данных завершается при частоте 50 кГц с блокадой величина нижнего предела 0,05 нА, хотя это может быть изменено с помощью программного обеспечения с помощью вкладки "Проанализировать Data '(в разделе' Настройки Analysis 'и' резистивный блокад ') ,
7. Поместите клетку Фарадея поверх клеточной системы для текучей среды для уменьшения электрического фонового шума на измерения.
8. Используйте модуль переменного давления (VPM) для применения давления или вакуума к образцам.
   1. Чтобы применить внешнее давление, подключите сопло к верхней ячейке жидкости, а затем поверните рычаг давления и нажмите на место (в зависимости от того, будет ли применяться положительное давление (PRE) или вакуум (VAC)).
   2. Подайте давление в "см" или "мм" шкалы с помощью ручки ступени давления, расположенный на верхней части ВПМ. Нажмите ручку вниз, чтобы оказать давление на шкале "см" и потяните его вверх тO оказать давление на шкале "мм".

8. Подготовка Образцы для анализа TRPS

1. Образцы вортексе в течение 30 сек и разрушать ультразвуком в течение 2 мин при 80 Вт до анализа TRPS.

9. Калибровка нанопор для анализа Зета

1. После размещения 40 мкл калибровочных частиц (1x10 ¹⁰ частиц / мл) в верхнюю ячейку жидкости, выполнить измерение TRPS (установка , как и в разделе 7) при 3 приложенных напряжений. Alter напряжение, нажав на кнопку "+" и "-" кнопки на шкале напряжения на вкладке "Настройки инструмента" на программном обеспечении.
2. Проверьте, что 3 напряжения возвращают фоновые токи около 140, 110 и 80 нА. Убедитесь в том, что при среднем напряжении калибровочные частицы создают среднюю величину блокады, по меньшей мере, 0,3 нА.
3. Примените давление таким образом, средняя максимальная полная ширина половины (FWHM) длительности калибровки частиц по меньшей мере,0,15 мс. Делайте это вручную с помощью рычага давления, прикрепленную к модулю переменного давления. Выбор давления (PRE) или вакуум (VAC), повернув рычаг до щелчка в нужном положении и применяются соответственно следующие настройки инструкции на этапе 7.8.2. После того, как эти условия были достигнуты, запустить прогон, нажав кнопку «Пуск» на программном обеспечении на вкладке "Сбор данных".
4. Выполните прогон, нажав "стоп" на вкладке "Сбор данных", когда по меньшей мере, 500 частиц были измерены (см 'количество частиц "в нижней части экрана программного обеспечения во время измерения) и пробег превысил 30 сек (см' Run Time 'также к нижней части экрана).
5. Калибровка системы путем заполнения калибровочного процесса, как описано каждый раз, когда новый нанопор вводится или для каждого нового дня анализа, выполнив шаг 9.1-9.4.

10. Запуск образца

1. Запуск образцов на самом высоком иливторое самое высокое напряжение в качестве калибровочных образцов при обеспечении аналогичной (± 10 нА), если не то же самое, базовый ток.
   1. После того, как соответствующий базовый ток достигается, заменить электролит в верхней камере жидкости с 40 мкл образца. Когда образец вводится, блокад будет видно на трассе сигнала. Запустить пример запуска, нажав кнопку "Пуск" на вкладке "Сбор данных" и записать минимум 500 частиц (проверить 'количество частиц', расположенный под след сигнала) и обеспечивает время работы составляет минимум 30 секунд (см 'Run Время 'также расположена ниже сигнальной дорожки).
   2. Для завершения измерения нажмите кнопку "стоп" в "закладке Сбор данных" и сохраните файл данных.
2. Чтобы сохранить файл, ввод сведений о файле в следующем формате; "Исследование" папка-файл будет сохранен в 'нанопористых ID' это порядковый номер поры используется I, 'Part #'S тип поры (т.е. NP150 / NP200), 'образец ID' это имя образца, "Калибровка или образец 'детали , является ли это калибровка или образец для измерения," разбавление "используется , если проба была разбавлена ( тип 100, если образец разводили в 100 раз), «давление» равно приложенное давление на образец (в см - см раздел 7.8), 'Электролит ID' это имя буфера образца состоит в, и ' Примечания "являются любые личные заметки о образце или бега.
3. Между каждым образцом перспективе, промывать систему не помещая 40 мкл PBST буфера в верхней камере жидкости в несколько раз, и применяя различные давления (как правило, при температуре от -10, -5 см (вакуум), а также 5 и 10 см (положительное давление)) до тех пор, больше нет блокады событий присутствуют, обеспечивая нет остаточные частицы, остающиеся в системе и, следовательно, нет перекрестного загрязнения между образцами. Запуск образцов в трех экземплярах с этой стадии промывки между завершенного каждого образца повторного запуска, как вэйл, как между различными образцами.

Результаты

Рисунок 1. Схематическое изображение процессов магнитной очистки и измерения TRPS. А) Пример магнитной очистки образца , начиная с образцом , содержащим избыток, несвязанный ДНК захвата зонда. B) TRPS из?...

Обсуждение

Расчет для дзета - потенциал был использован метод , основанный калибровки связано с работой по Arjmandi и др. ^21. Продолжительность транслокацию частиц при их прохода по нанопор измеряется в зависимости от приложенного напряжения, используя среднее электрическое поле и части...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V