Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d'ADN modifié comme un exemple

Résumé

Ici, nous utilisons un nanopore accordable en polyuréthane intégré dans une technique de détection d'impulsions résistif pour caractériser les nanoparticules de la chimie de surface par la mesure des vitesses de translocation de particules, qui peut être utilisé pour déterminer le potentiel zéta des nanoparticules individuelles.

Résumé

technologies de Nanopore, connus collectivement comme capteurs de pulsations résistifs (RPS), sont utilisées pour détecter, quantifier et caractériser les protéines, les molécules et les nanoparticules. détection d'impulsion résistive accordable (de TRPS) est une adaptation relativement récente au RPS qui incorpore un pore accordable peut être modifiée en temps réel. Ici, nous utilisons TRPS pour surveiller les temps de translocation des nanoparticules d'ADN modifiées comme ils traversent la membrane poreuse réglable en fonction de la concentration d'ADN et de la structure ( par exemple, simple brin en ADN double brin).

TRPS repose sur deux électrodes Ag / AgCl, séparés par une membrane poreuse en élastomère qui établit un courant ionique stable lors d'un champ électrique appliqué. Contrairement à diverses technologies de caractérisation des particules optiques à base, TRPS peuvent caractériser des particules individuelles dans une population de l'échantillon, ce qui permet pour les échantillons multimodales à analyser avec facilité. Ici, nous démontrons mesures du potentiel zêtavia des vitesses de translocation de particules de normes connues et les appliquer à l'échantillon des temps de translocation analyte, conduisant ainsi à la mesure du potentiel zeta de ces analytes.

En plus d'acquérir des valeurs de potentiel zêta moyennes, les échantillons sont tous mesurés en utilisant une perspective particule par particule présentant plus d'informations sur un échantillon donné par l'échantillon répartition de la population, par exemple. De ce fait, cette méthode démontre un potentiel dans les applications de détection pour les domaines médicaux et environnementaux.

Introduction

nanoparticules fonctionnalisés sont de plus en plus populaire en tant que biocapteurs dans les deux domaines de la médecine et de l'environnement. La possibilité de modifier la chimie de surface d'une nanoparticule, avec de l' ADN, par exemple, se révèle utile pour les systèmes de délivrance de médicaments ciblés ¹ et de suivi des interactions ADN-protéines ^2-4. Une propriété de nanoparticules de plus en plus commun étant utilisé dans des essais biologiques et dans la prestation de produits thérapeutiques est superparamagnétisme ^5. particules superparamagnétiques (SPPS) sont extrêmement utiles pour identifier et éliminer les analytes spécifiques à partir de mélanges complexes et peuvent le faire avec la simple utilisation d'un seul aimant. Une fois enlevés, les particules d'analyte lié peuvent être caractérisés et analysés adaptés à l'usage.

Les procédés antérieurs utilisés pour la détection et la caractérisation des nanoparticules comprennent des techniques optiques telles que la diffusion dynamique de lumière (DLS), autrement connu comme la spectroscopie de corrélation de photons. Bien qu'un saluttechnique de débit gh, DLS est limitée à être une technique basée sur la moyenne et lors de l' analyse des échantillons multimodaux sans ajout de logiciels spécialisés, les plus grosses particules produisent un signal beaucoup plus dominante, laissant certaines des plus petites particules complètement inaperçues ^6,7. Particule par particule techniques de caractérisation sont donc beaucoup plus favorable pour analyser nanoparticule et les systèmes de nanoparticules fonctionnalisés.

technologies basées RPS sont basés sur l'application d'un champ électrique à un échantillon et la surveillance du mécanisme de transport des particules à travers un nanopore synthétique ou biologique. Une technique relativement récente de détection de nanoparticules et la caractérisation basée sur RPS est résistive accordable impulsion de détection (TRPS) ^8-16. TRPS est un système à deux électrodes séparées par une membrane poreuse en élastomère, accordable. Une méthode accordable de pores permet analytes d'une gamme de forme ¹⁷ et la taille à mesurer via leur transdes mécanismes de port à travers les pores. Les pores accordables ont déjà été utilisés pour la détection de petites particules (diamètre 70-95 nm) produisant des résultats comparables à d' autres techniques telles que la spectroscopie électronique à transmission (MET) ^10. Lorsqu'un champ électrique est appliqué, un courant ionique est observé et que des particules / molécules passent à travers les pores, ils bloquent temporairement les pores, ce qui provoque une réduction du courant qui peut être défini comme un «événement de blocage. Chaque événement de blocus est représentatif d'une seule particule de sorte que chaque particule dans un échantillon peut être caractérisé individuellement en fonction de l'ampleur du blocus, Δ Et toute la largeur à mi-hauteur, LMH, ainsi que d' autres propriétés de blocus. L'analyse des particules individuelles lors de leur passage à travers un nanopore est avantageux pour les échantillons multimodales comme TRPS peuvent réussir et efficacement distinguer une gamme de tailles de particules amongst un seul échantillon. Accordable détection d'impulsion résistive complète taille ^10, zeta potentiels ^12,18 et la concentration de ¹⁵ mesures simultanément en une seule opération et peut donc différencier encore des échantillons de semblable, sinon la même taille par leur charge de surface ^19; un avantage par rapport aux techniques de dimensionnement alternatives.

Le potentiel zêta est défini comme étant le potentiel électrostatique au niveau du plan de cisaillement ^20, et elle est calculée à partir des vitesses de particules comme ils traversent un pore ^19. mesures de potentiel Zeta de particules individuelles donne ainsi un aperçu des mécanismes et le comportement des systèmes de nanoparticules en solution, de précieuses informations pour l'avenir des modèles de test de nanoparticules pour une gamme d'applications translocation. analyse de particules par particule de cette nature permet également la diffusion et la distribution des valeurs de potentiel zêta parmi un échantillon de population à explorer, permettant plus d'informations ocinétique n de réaction (simple brin à l'ADN double brin, par exemple) et des stabilités de particules en solution à atteindre.

Ici, nous décrivons une technique qui détecte et caractérise les deux surfaces SPP non modifiées et modifiées par l'ADN. Le protocole décrit ici est applicable à toute une gamme de nanoparticules inorganiques et biologiques, mais nous démontrons la procédure en utilisant des surfaces d'ADN modifiées en raison de leur large éventail d'applications. Cette technique permet à l'utilisateur de distinguer entre les cibles d'ADN simple brin et double brin sur une surface nanoparticulaire, sur la base des vitesses de translocation de particules à travers un système de pores et donc leurs potentiels zêta.

Protocole

1. Faire de la saline tamponnée au phosphate avec du Tween-20 (PBST) Buffer

1. Dissoudre un comprimé de PBS (0,01 M tampon phosphate 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium, pH 7,4) dans 200 ml d'eau déminéralisée (18,2 MQ cm).
2. Ajouter 100 ul (0,05 (v / v)%) Tween-20 à la solution tampon de 200 ml en tant que tensio-actif.

2. Préparation des normes de particules Carboxyl Polystyrène

1. Vortexer les particules d'étalonnage pendant 30 secondes avant la sonification pendant 2 minutes à 80 watts pour créer monodispersité des particules.
2. Diluer les particules d'étalonnage à 1 100 à une concentration de 1x10 ¹⁰ particules / ml dans un tampon PBST et vortexer pendant 30 secondes.

3. Préparation des particules recouvertes de streptavidine

1. Vortex les particules pendant 30 secondes avant sonication pendant 2 min à 80 watts pour assurer monodispersité.
2. Diluer les particules revêtues de streptavidine 1 à 100 dans un tampon PBST à courant alternatifHieve une concentration résultante de 1x10 ⁹ particules / ml et vortexer pendant 30 secondes.
   Remarque: Un volume d'échantillon typique est de 200 ul. Par exemple, si l'instruction cinq concentrations d'ADN préparer 1 ml de particules revêtues de streptavidine diluées.

4. Préparation d'oligonucléotides

1. Reconstituer oligonucléotides avec de l'eau déminéralisée à une concentration résultante de 100 uM.

5. Ajout de capture de la sonde (CP) de l'ADN aux particules recouvertes de streptavidine

1. Avant de liaison à l'ADN, vortex les streptavidine particules enrobées (200 volumes d'échantillon pi) pendant 30 secondes, suivie d'une 2 min sonication à 80 watts.
2. Sur la base de la capacité de liaison fournie par le fournisseur (4352 pmol / mg), d'ajouter la concentration appropriée de l'ADN aux particules pour les concentrations résultantes de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 et 210 nM d'ADN.
3. Vortex les échantillons pendant 10 secondes et les placer sur une roue rotative à la température ambiantependant 30 minutes pour permettre à l'ADN de se lier aux surfaces des particules par l'intermédiaire d'une interaction streptavidine-biotine.
4. Une fois que l'ADN de capture a été ajouté et mis en incubation avec les particules revêtues de streptavidine, éliminer l'excès d'ADN en solution par l'intermédiaire d'une séparation magnétique en plaçant les échantillons sur une grille magnétique pendant 30 min.
5. Retirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le cluster nouvellement formé de particules les plus proches de l'aimant, et le remplacer par le même volume de nouveau tampon de PBST.

6. Hybridation ADN complémentaire aux CP-particules

1. Ajouter la quantité requise de l'ADN cible (en excès à 500 nM) pour assurer la liaison a été atteint la cible maximale possible.
2. Vortex les échantillons pendant 10 secondes et les placer sur une roue rotative à la température ambiante pendant 30 min.
3. Une fois que l'hybridation est terminée, retirez l'ADN cible en excès par séparation magnétique en plaçant les échantillons sur une grille magnétique pendant 30 min.
4. Retirer le surnageant, En prenant soin de ne pas perturber le cluster nouvellement formé de particules les plus proches de l'aimant, et le remplacer par le même volume de nouveau tampon de PBST.
5. Répétez les étapes 6.1 à 6.4 pour les échantillons en double et placer ces échantillons sur une roue rotative à la température ambiante pendant 16 heures pour étudier les temps d'hybridation d'ADN.

Configuration 7. TRPS

1. Branchez l'appareil dans un système informatique avec le logiciel en place.
2. Calibrer le tronçon initial à l'aide d'un étrier.
   1. Mesurer la distance entre l'extérieur des deux mâchoires parallèles.
   2. Entrée dans le logiciel en tapant l'étirement dans le champ «stretch» ​​dans l'onglet «Paramètres Instrument et en cliquant sur« Calibrer stretch 'sous l'onglet.
3. Latéralement adapter une membrane de polyuréthane nanopore de dimensionnement approprié pour l'analyse sur les mâchoires avec le nombre nanopore ID vers le haut. Ensuite, étirer les mâchoires à l'étirement nécessaire à l'analyse à l'aide duPoignée de réglage extensible sur le côté de l'instrument. Étirez les mâchoires entre 43 et 48 mm.
   Note: La valeur exacte de l'étendue est déterminée aux côtés de la tension appliquée afin que les blocages d'étalonnage de particules sont au moins 0,3 nA en taille. Le tronçon est déjà entré dans le logiciel à l'étape 7.2 et ajustera automatiquement les mâchoires sont tendues.
4. Placez 80 pi de tampon PBST dans la cellule fluide inférieure, sous le nanopore, assurant qu'il n'y a pas de bulles présentes qui peuvent affecter la mesure. S'il y a des bulles vu, enlever et remplacer le tampon.
5. Cliquez sur la cellule de fluide supérieure en place et placer 40 ul de tampon en elle, assurant à nouveau il n'y a pas de bulles présente. Si des bulles sont présentes dans la cellule fluide supérieur, retirez-les en remplaçant le liquide.
6. Lorsqu'un courant de référence reproductible a été atteint de remplacer la cellule de fluide supérieure avec un tampon, ajouter 40 ul de l'échantillon dans la cellule de mesure de fluide supérieure et en cliquant sur "start "dans l'onglet" Data Acquisition "sur l'écran du logiciel.
   Remarque: L'acquisition des données est terminée à une fréquence de 50 kHz avec une limite d'une magnitude de blocage inférieure de 0,05 nA, même si cela peut être modifié à l'aide du logiciel via l'onglet 'Analyse de données' (sous la rubrique «Paramètres d'analyse» et «Resistive Blockades ') .
7. Placer une cage de Faraday sur la partie supérieure du système de cellules de fluide pour réduire le bruit de fond électrique sur les mesures.
8. Utilisez un module de pression variable (VPM) pour appliquer une pression ou un aspirateur pour les échantillons.
   1. Pour appliquer une pression externe Brancher la buse sur la cellule fluide supérieur, puis tourner le bras de pression et cliquez en place (selon que la pression positive (PRE) ou un vide (VAC) seront appliqués).
   2. Appliquer une pression dans un «cm» ou échelle »mm» en utilisant le bouton de niveau de pression situé sur le haut de la VPM. Appuyez sur le bouton vers le bas pour appliquer une pression sur l'échelle «cm» et tirer vers le haut to appliquer une pression sur l'échelle 'mm'.

8. Préparation des échantillons pour l'analyse de TRPS

1. échantillons Vortex pendant 30 secondes et sonication pendant 2 min à 80 watts avant l'analyse de TRPS.

9. Calibrage de l'Nanopore pour l'analyse Zeta

1. Après avoir placé 40 particules d'étalonnage ul (1x10 ¹⁰ particules / ml) dans la cellule fluide supérieur, effectuer une mesure de TRPS (configuration comme dans la section 7) à 3 tensions appliquées. Modifiez la tension en cliquant sur le '+' et '-' des boutons sur l'échelle de tension dans l'onglet "Paramètres Instrument sur le logiciel.
2. Vérifiez que les 3 tensions retour courants d'environ 140, 110 arrière-plan, et 80 nA. Veiller à ce que, à la tension moyenne des particules d'étalonnage produisent une magnitude de blocage moyenne d'au moins 0,3 nA.
3. Appliquer une pression de sorte que la moitié pleine largeur maximale moyenne (FWHM) durées des particules d'étalonnage sont au moins0,15 ms. Pour ce faire manuellement à l'aide du bras de pression fixé au module de pression variable. Sélectionnez la pression (PRE) ou vide (VAC) en faisant tourner le bras jusqu'à ce qu'il clique dans la position désirée et appliquer en conséquence ce qui suit a mis en place des instructions à l'étape 7.8.2. Une fois que ces conditions ont été atteints, commencer la course en cliquant sur «start» sur le logiciel dans l'onglet «Acquisition des données».
4. Terminez la course en appuyant sur «stop» dans l'onglet «Acquisition des données» quand au moins 500 particules ont été mesurées (voir «comte de particules" au bas de l'écran du logiciel lors de la mesure) et la course a dépassé 30 sec (voir ' Run Time 'également vers le bas de l'écran).
5. Calibrer le système en remplissant une course d'étalonnage comme indiqué chaque fois qu'une nouvelle nanopore est introduite ou pour chaque nouveau jour de l'analyse en remplissant étape 9.1-9.4.

10. Exécution d'un échantillon

1. Exécutez les échantillons au plus haut oudeuxième tension la plus élevée que les échantillons d'étalonnage à assurer un similaire (± 10 nA), sinon le même, le courant de référence.
   1. Une fois que le courant de référence approprié est atteint, remplacer l'électrolyte dans la cellule de fluide supérieure à 40 pl de l'échantillon. Quand un échantillon est introduit, les blocages seront visibles sur la trace du signal. Démarrez l'échantillon exécuter en cliquant sur 'start' dans l'onglet "Data Acquisition" et enregistrer un minimum de 500 particules (cocher «nombre de particules» situé sous la trace du signal) et assurer le temps d'exécution est un minimum de 30 secondes (voir 'Run Time 'également situé au-dessous de la trace du signal).
   2. Pour terminer la mesure, cliquez sur «stop» dans l'onglet "Data Acquisition" et enregistrez le fichier de données.
2. Pour enregistrer le fichier, saisissez les informations de fichier dans le format suivant; «Enquête» est le dossier le fichier sera enregistré dans, 'Nanopore ID' est le numéro de série du pore utilisé, 'Part #' iest le type de pores (ie, NP150 / NP200), «ID échantillon» est le nom de l'échantillon, 'étalonnage ou de l' échantillon "détails si elle est une mesure d'étalonnage ou de l' échantillon,« Dilution »est utilisé si l'échantillon a été dilué ( tapez 100 si l'échantillon a été dilué 100 fois), «pression» est la pression appliquée à l'échantillon (en cm - voir la section 7.8), 'Electrolyte ID' est le nom de la mémoire tampon de l'échantillon est composé de, et ' Remarques »sont des notes personnelles sur l'échantillon ou courir.
3. Entre chaque échantillon run, laver le système en plaçant 40 pl de PBST tampon dans la cellule fluide supérieur à plusieurs reprises et en appliquant différentes pressions (habituellement à -10, -5 cm (vide), et 5 et 10 cm (à pression positive)) jusqu'à ce que pas plus d'événements de blocus sont présents, assurant qu'il n'y a pas de particules résiduelles dans le système, et donc pas de contamination croisée entre les échantillons. échantillons en triple avec cette étape de lavage terminé entre chaque échantillon de répétition fonctionnent comme well entre différents échantillons.

Résultats

Figure 1. Représentation schématique des procédés de purification magnétique et une mesure de TRPS. A) Exemple de purification magnétique de l' échantillon à partir d'un échantillon contenant un excès, l' ADN de sonde de capture non lié. B) TRPS exemple de mesure i) des particules passant par le nanopore et ii) événement Blockade produite à ...

Discussion

Le calcul du potentiel zêta utilisé une méthode basée sur l' étalonnage lié au travail par Arjmandi et al. ^21. La durée de la translocation des particules lorsqu'elles traversent un nanopore est mesurée en fonction de la tension appliquée, en utilisant une vitesse moyenne de champ électrique et de particules sur la totalité d'un pore conique régulière. La mobilité électrophorétique est la dérivée de 1 / T (où T est la durée du blocage) par rapport à la tension, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary - 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding - 5'GTAGTGAGGT3', End binding - 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V