1 Zu Beginn erhalten Sie Ligandenfärbezellen2, die ein Halo-markiertes Protein von Interesse und Halo H2B exprimieren. 3 Stellen Sie nach dem Einschalten des Mikroskopsystems 4 die Inkubationsparameter für lebende Zellen 5 ein und lassen Sie das System äquilibrieren. 6 Geben Sie einen Tropfen des Öls auf 7 ein 100x TIRF-Objektiv am Mikroskop 8 und laden Sie die Zellprobe auf den Mikroskoptisch.
9 Um eine morphologisch gesunde Zelle zu identifizieren, 10 wird die Z-Position 11 eingestellt und die Zellprobe unter Hellfeldbeleuchtung abgebildet. 12 Beschneide das Sichtfeld, um den Zielzellkern einzufangen. 13 Passen Sie unter Verwendung der Laserbeleuchtung den TIRF-Winkel 14 an, um eine Hilo-Beleuchtung mit einem optimalen Signal-Rausch-Verhältnis von 15 für ein einzelnes Molekül zu erreichen.
16 Stelle dann die Belichtungszeit auf 500 Millisekunden ein. 17 Während der Totzeit zwischen den Bildern 18 photoaktivieren die Moleküle 19 mit einem 111 Mikrowatt 405 Nanometer Strahl, 20 und regen bei jeder Belichtung H2B-Halomoleküle 21 mit einem 9,1 Milliwatt 640 Nanometer Strahl an. 22 Initiieren Sie die Bilderfassung für 2000 Bilder kontinuierlich 23 und erhöhen Sie allmählich die Leistung des 405-Nanometer-Strahls 24 bei Reduzierung der photoaktivierten Moleküle.
25 Für ein Halo-markiertes Protein von Interesse teilten 26 Emissionswellenlängen zwischen zwei Kameras 27 unter Verwendung eines dichroitischen Langpassspiegels auf. 28 Zu den gleichen Erfassungsparametern, die zuvor demonstriert wurden, 29 wird ein JFX549-Kanal hinzugefügt, um alle 10 Sekunden 30 ein Frame zu erfassen und kontinuierlich 2000 Frames zu erfassen.
