1 Führen Sie zunächst eineEinzelmolekül-Bildgebung von HaloTag-Proteinkondensaten mit lebenden Zellen 2 durch. 3 Konvertieren Sie mit ImageJ jeden Kanal 4 aus der Rohbilddatei 5 in eine unabhängige TIFF-Datei. 6 Führen Sie bei Bedarf einen Pre-Tracking-Kamm aus.
Geben Sie den Text 7 ein, und befolgen Sie die Anweisungen 8, um alle Frames durch die neuesten zu ersetzen. 9 Um das einzelne Molekül einer Filmdatei in SlimFast zu laden, 10 klicken Sie auf Laden, gefolgt von Bildstapel. 11 Legen Sie die Parameter für die Lokalisierung 12 und die Erfassung unter den entsprechenden Optionsblättern fest.
13 Visualisiere die Lokalisationen aller Moleküle. 14 Und mit lock all erzeugt 15 eine Datei, die die Lokalisierungen 16 aller Moleküle in jedem Frame enthält. 17 Gehen Sie als Nächstes zu Partikeldaten laden 18 und wählen Sie SlimFast, um die Datei 19 mit den Lokalisierungs- und Erfassungseinstellungen zu laden.
20 Passen Sie mit der Option und der Blattverfolgung 21 die Parameter für die Bahngenerierung an. 22 Klicken Sie auf gen traj, um eine Datei 23 zu erzeugen, die die Trajektorien aller Moleküle enthält. 24 Laden Sie die Blatt-Track-Datei in eval SPT 25 und stellen Sie die Parameter 26 ein, um die Trajektorien herauszufiltern, die kürzer als 2,5 Sekunden sind.
27 Erzeugen Sie unter Verwendung von Exportdaten eine Datei 28 mit allen gefilterten Trajektorien. 29 Ausführen des ImageJ-Makros, des Nucleus, 30 und der Clustermaske Version zwei. Text, 31 Schwellenwert für alle Frames des Films, die 32 im JFX549-Kanal erfasst wurden, um einen Zeitrafferfilm 33 zu erzeugen, der mit der zeitentwickelnden Binärmaske 34 bestückt ist, die Kondensatstellen hervorhebt.
35 Verwenden von convert ASCII slow tracking CSS 3. M, 36 formatieren die Trajektorien 37 neu und führen die Kategorisierungsversion 4 aus. M 38, um sie nach der Lebensdauer 39 zu sortieren, die ein Molekül in einem Kondensat verbringt.
40 Sodann unter Verwendung von plot residence hist CSS. M, 41 extrahieren die beobachtete Dissoziationsrate 42 von spezifisch gebundenen Molekülen 43 und die Photobleichrate aus dem interessierenden Protein im Kondensat 44 und den H2B-Trajektorien. 45 Berechnen Sie schließlich die korrigierte mittlere Verweilzeit 46 des interessierenden Proteins 47, das spezifisch an seine Kondensate gebunden ist.
48 Ein Ausschnitt aus dem zweifarbigen Einzelmolekülfilm 49 von TAF15 IDR-Halo-FTH1 zeigt Signale 50 aus dem Zellkern sowohl im PA-JF646- als auch im JFX549-Kanal. 51 Beim Zusammensetzen und Sortieren 52 wurde eine klare Unterscheidung für die Trajektorien 53 von PA-JF646 detektierten Molekülen beobachtet, die an die Kondensate gebunden waren. 54 Die berechneten mittleren Verweilzeiten 55 nach Korrektur für das Photobleaching 56 waren für TAF15-Halo-FTH1 höher als für Halo-TAF15.
