Nachdem Sie Endothelzellen in der 96-Well-Platte gezüchtet haben, nehmen Sie sie aus dem Inkubator und bestätigen Sie die Konfluenz mit einem inversen Mikroskop. Schnippe die Platte in ein Waschbecken, um das gesamte Medium zu entfernen, und tupfe die Oberseite der Platte mit einem Papiertuch ab. Geben Sie HBSS HEPES Assay-Puffer plus Probenecid-Lösung in ein 50-Milliliter-Mehrkanal-Pipetten-Lösungsmittelreservoir.
Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter Assay-Puffer in jede Vertiefung und lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang ruhen. Schnippen Sie dann mit der Platte, um den Assay-Puffer zu entfernen. Geben Sie den Download-Puffer in ein separates 50-Milliliter-Mehrkanal-Pipetten-Lösungsmittelreservoir.
Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter des Farbstoffbeladungspuffers in jede Vertiefung der Assay-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 45 Minuten. Beobachten Sie die Platte nach der Inkubation unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Farbstoffaufnahme zu bestätigen.
Schnippe über die Platte, um die Färbelösung zu entfernen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 50 Mikrolitern des HBSS HEPES-Assay-Puffers plus Probenecid-Lösung in jeder Vertiefung. Schnippen Sie mit der Platte, um den Assay-Puffer zu entfernen.
Geben Sie 92 Mikroliter HBSS HEPES-Assay-Puffer in jede Vertiefung und betrachten Sie die Zellen erneut mit einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass überschüssiger Farbstoff vollständig entfernt wurde und die Zellen adhärent bleiben. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette zwei Mikroliter der Antagonistenlösungen und des Vehikels in die entsprechenden Vertiefungen. Stellen Sie nach dem Einschalten des Plattenlesegeräts die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang.
Messen Sie die Hintergrundfluoreszenz in den Spalten eins und zwei und führen Sie fünf Scans pro Vertiefung durch. Werfen Sie die Platte aus dem Plattenlesegerät aus, dann aus einem PCR-Streifen mit 8 Röhrchen und fügen Sie schnell sechs Mikroliter Agonistenlösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung in den Spalten eins und zwei hinzu. Messen Sie die Änderung der Fluoreszenz, wenn die Kalziummobilisierung in den Zellen stattfindet.
Führen Sie 20 Scans jeder Vertiefung durch. Der Kalziummobilisierungsassay mit Endothelzellen zeigte, dass Positivkontrollvertiefungen ohne Antagonisten einen schnellen Anstieg der Fluoreszenz zeigten. Vertiefungen mit hohen Antagonistenkonzentrationen zeigten eine minimale Änderung der Fluoreszenz, ähnlich wie die negativen Kontrollvertiefungen ohne Agonisten.
