Führen Sie die Einzelmolekül-Bildgebung in einem kommerziellen Aufbau durch, indem Sie eine optische Doppelstrahlpinzette mit konfokaler Mikroskopie kombinieren. Verwenden Sie den ersten Injektionskanal für das Bead-Trapping, den zweiten Kanal für die Bindung an DNA-Proteinkomplexe, den dritten Kanal für die Überprüfung des Vorhandenseins von CMG und die Kanäle vier und fünf als Proteinreservoire und Pufferaustauschstellen. Fließen Sie alle Lösungen mit einem konstanten Druck von 0,5 bar in die Durchflussmesse.
Schalten Sie dann den Durchfluss in den Kanälen vier und fünf aus. Nachdem Sie zunächst alle Lösungen fließen lassen, reduzieren Sie den Druck auf 0,2 bar. Bewegen Sie die Fallenlaser, um einen zu kanalisieren, bis eine Perle in jeder optischen Falle gefangen ist.
Bewege gefangene Perlen zu Kanal zwei, indem du den Joystick bewegst, während du den Auslöser drückst. Mit dem Joystick ohne Drücken des Abzugs wird ein DNA-CMG-Komplex gefischt, indem die rechte Perle auf die linke Perle zu und von ihr weg bewegt wird, bis ein DNA-Seil gefangen ist. Bewegen Sie die Perlen zu Kanal drei und stoppen Sie sofort den Fluss in allen Kanälen.
Stellen Sie die Laserleistung von 561 Nanometern im Anregungslaserpanel auf vier Mikrowatt ein und führen Sie dann einen Ein-Frame-Testscan der DNA in Kanal drei durch. Falls vorhanden, erscheint CMG als zweidimensionale beugungsbegrenzte Flecken. Verschieben Sie in diesem Fall das DNA-Tether für die Bildgebung entweder auf Kanal vier oder fünf.
Andernfalls schalten Sie den Fluss wieder ein, entsorgen Sie die Perlen und wiederholen Sie die Schritte. Geben Sie in den Kanälen vier oder fünf zwei Piconewtons in das Kraftspektroskopie-Panel ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Aktivieren, um eine Kraftklemme zu starten. Sobald die Anfangsspannung zwei Piconewtons erreicht, deaktivieren Sie die Kraftklemme vor der Bildgebung, indem Sie erneut auf die Aktivierungsschaltfläche in der Kraftspektroskopie-Platte klicken.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan starten im Bildscanfenster. Bilden Sie das fluoreszierende CMG alle fünf Sekunden mit einem 561-Nanometer-Laser mit einer Leistung von vier Mikrowatt ab, wie am Objektiv gemessen. In einer aggregationsfreien Reaktion trat CMG als diskrete, symmetrische beugungsbegrenzte Flecken auf, die die DNA spärlich bevölkerten.
Im Gegensatz dazu sind Aggregate weniger diskrete, manchmal asymmetrische Klumpen, die sich über eine größere Länge der DNA erstrecken. Wenn der Assay erfolgreich durchgeführt wurde und eine hohe Reinheit der gereinigten Proteine erreicht wurde, konnte eine Langstreckenbewegung von CMG in Gegenwart von ATP beobachtet werden.
