Bildung von Human Periodontal ligament Cell Spheroids auf Chitosan Filmen

Dies ist ein detailliertes Protokoll der Kultivierung parodontalen Bandzellsphäriden durch Chitosan-Filme. Im Vergleich zum herkömmlichen Kultursystem produziert das Sphäroid-Kultursystem parodontale Bandzellen mit erhöhter Selbsterneuerung und osteogenen Differenzierungsfähigkeiten. Bereiten Sie zunächst 1% Gewicht-zu-Volumen-Chitosan-Lösung vor, wie im Manuskript angegeben.

Fügen Sie 0,5 Milliliter Chitosan-Lösung in jeden Brunnen einer 24-Well-Gewebekultur Polystyrolplatte. Trocknen Sie die Platte in einem Ofen bei 60 Grad Celsius für 24 Stunden, um Chitosan-Filme zu bilden. Um die Chitosan-Filme zu neutralisieren, fügen Sie 0,5 Milliliter 0,5 normales Natriumhydroxid in jeden Brunnen der 24-Well-Platte und inkubieren bei Raumtemperatur für zwei Stunden.

Dann die Chitosan-Filme dreimal mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Sterilisieren Sie die chitosanbeschichtete 24-Well-Platte in 70% Alkohol über Nacht bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Platte dreimal mit PBS und lassen Sie sie dann über Nacht unter ultraviolettem Licht.

Vor der Zellaussaat, vorwarmend Proliferation sende Medium, PBS-Lösung, und Trypsin EDTA-Lösung auf 37 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand aus dem Zellkulturkolben und waschen Sie das konfluente Parodontalband oder PDL-Zellen mit 10 MilliliterPBS. Entsorgen Sie die PBS und fügen Sie dem Kolben einen Milliliter Trypsin EDTA-Lösung hinzu.

Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius für drei Minuten und fügen Sie dann drei Milliliter Proliferationsmedium hinzu, um die Trypsin-Verdauung zu beenden. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 Milliliter konisches Rohr und zentrieren Sie sie dann für fünf Minuten bei 300 mal g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter Proliferationsmedium wieder aus.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie sie auf die Platte bei fünf, 10, 30 und 60 Tausend Zellen pro Quadratzentimeter. Kultur die PDL-Zellen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid und befeuchteter Luft, verändert das Kulturmedium zweimal pro Woche. Beobachten Sie die Zellmorphologie täglich fünf Tage lang über ein inverses Phasenkontrastmikroskop.

Mit diesem Protokoll werden lebensfähige PDL-Zellsphäride erfolgreich gebildet. Sphäroide werden selten für die niedrigere Saatdichte an den Tagen eins und drei beobachtet. Aber bei den beiden höheren Dichten sind vom ersten Tag an verschiedene Größen von Sphäroiden vorhanden.

Die optimale Saatdichte beträgt 30 Tausend Zellen pro Zentimeter quadratisch, da sie zu homogenen Sphäroiden führt. Nach fünf Tagen Kultur werden größere Sphäroide für alle Sädichten beobachtet. Ein Lebensfähigkeitstest zeigt, dass die Mehrheit der PDL-Zellen an den Tagen eins, drei und sechs am Leben sind, aber die Anzahl der abgestorbenen Zellen steigt an Tag sechs.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die verminderte Proliferation von Zellen nach Sphäroidbildung. Daher sind weitere Studien zur Förderung der Zellproliferation nach Sphäroidbildung erforderlich.