Channelrhodopsin-unterstützte Schaltungszuordnung ist eine Präzisionstechnik für die funktionelle Kartierung von langräumigen neuronalen Projektionen. Hier zeigen wir, wie man diesen Ansatz nutzt, um Schaltkreise im auditiven Hirnstamm zu untersuchen. In Gehirnscheiben werden Axone aus mehreren Quellen oft vermischt, was es schwierig macht, einzelne Eingänge mittels elektrischer Stimulation zu isolieren.
Durch die Verwendung von CRACM kann diese Einschränkung überwunden werden. Lambda zu finden und das stereotaxic-Koordinatensystem konsequent zu definieren, ist ebenso schwierig wie die Dauer des Verfahrens kurz zu halten. Wenn alle Schritte sorgfältig abgebildet werden, erhöht sich Ihre Erfolgsquote.
Beginnen Sie mit dem Sprühen des Operationsbereichs mit 70% Ethanol, um zu desinzipieren und sterile Handtuchvorhänge zu platzieren, um den Operationsbereich abzudecken. Entfernen Sie Käfigbetten, um das Erstickungsrisiko aus dem Bergungskäfig zu begrenzen. Als nächstes legen Sie ein Heizkissen unter den Käfig und stellen Sie eine Nahrungs- und Wasserquelle zur Verfügung.
Als nächstes übertragen Sie das Tier in einen stereotaxic Rahmen und setzen Sie die Anästhesie fort. Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und schalten Sie den hausostatischen Temperaturregler ein. Wenden Sie dann die ophthalmologische Salbe an, um zu verhindern, dass die Augen austrocknen.
Präemptive analgetisch verabreichen. Schließlich rasieren Sie die Kopfhaut mit elektrischen Clippers. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Tupfern Povidonjod und 70%Ethanol.
Beginnen Sie die Operation, indem Sie einen Schnitt in der Kopfhaut entlang der Mittellinie machen, beginnend zwischen den Ohren und weiter rostral zu den Augen, die Lambda und Bregma Nähte aussetzen. Schieben Sie die Haut zur Seite und entfernen Sie bei Bedarf Periost aus dem exponierten Knochen. Als nächstes markieren Sie die Lambda-Nähte mit einem chirurgischen Marker, positionieren Sie die Spitze des Nano-Injektors so, dass sie nur Lambda berührt und die Mikromanipulator-Koordinaten null.
Verwenden Sie die Nano-Injektorspitze und den Mikromanipulator, um den Höhenunterschied zwischen Lambda- und Bregma-Nähten zu messen. Passen Sie die Höhe der Palettenbalken an, um Lambda und Bregma auf einen Höhenunterschied von plus oder minus 100 Mikrometer zu bringen. Ordnen Sie die Injektionsstelle mit dem Nano-Injektor-Spitzen- und Mikromanipulator-Koordinatensystem zu und markieren Sie die Stelle mit einem chirurgischen Marker.
Verwenden Sie dann einen Mikromotorbohrer mit einem 0,5-Millimeter-Bohrgrat, um eine Kraniotomie über der Injektionsstelle durchzuführen. Um eine breite Transfektion von Neuronen im Zielkern zu gewährleisten, verwenden Sie einen Nano-Injektor, um Injektionen in verschiedenen Tiefen des Gewebes zu machen und im Falle größerer Hirnregionen, wie des unteren Colliculus, Injektionen im Laufe von zwei oder mehr Penetrationen an verschiedenen X- und Y-Koordinaten zu machen. Um den minderwertigen Colliculus zu injizieren, lagern Sie 20 Nanoliter Virus in den Intervallen von 250 Mikrometern entlang der Z-Achse zwischen 2, 250 Mikrometern und 1, 750 Mikrometer Tiefe ab.
Bei Injektionen in den dorsalen Cochlea-Kern 20 Nanoliter Virus in einer Tiefe von 4, 750 Mikrometern bzw. 4, 550 Mikrometern ablagern. Nach der Injektion an jeder Z-Koordinate warten Sie zwei bis drei Minuten, bevor Sie den Injektor auf die nächste Z-Koordinate verschieben, um Zeit für die Verbreitung des Virus von der Injektionsstelle zu lassen, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass das Virus im Injektionstrakt angesaugt wird, wenn der Nanoinjektor neu positioniert wird. Dann, nach der letzten Injektion, warten Sie drei bis fünf Minuten, bevor Sie den Nanoinjektor aus dem Gehirn zurückziehen.
Wenn der Nano-Injektor zwischen Penetrationen und zwischen Tieren aus dem Gehirn entfernt wird, werfen Sie ein kleines Virusvolumen aus der Spitze aus, um zu überprüfen, ob die Spitze nicht verstopft ist. Nach Injektionen verwenden Sie steriles PBS, um die Schnittkanten der Kopfhaut zu befeuchten und dann die Haut sanft zurück in Richtung Mittellinie zu bewegen. Schließen Sie die Wunde mit einfachen unterbrochenen Nähten mit 6-0 Nylon Nähte.
Dann 0,5 bis einen Milliliter 2%Lidocain-Gelee auf die Wunde auftragen. Entfernen Sie die Ohrstangen und Temperatursonde, drehen Sie Isofluran, und entfernen Sie das Tier aus der Palettenleiste und übertragen Sie es in den Erholungskäfig. Überwachen Sie schließlich die Wiederherstellung genau.
Sobald das Tier vollständig wach ist, sich bewegt und keine Anzeichen von Schmerz oder Bedrängnis zeigt, überträgt es es zurück in seinen Käfig und gibt den Käfig ins Vivarium zurück. Verwenden Sie Standard-Patch-Clamp-Methoden, um Aufnahmen zu machen. Beginnen Sie, indem Sie die Scheibe in einer Aufnahmekammer unter einem festen Bühnen-Upright-Mikroskop platzieren und kontinuierlich mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei zwei Millilitern pro Minute überschwängen.
Als nächstes patchen Neuronen unter visueller Kontrolle mit einem geeigneten Patch Klemmverstärker. Schließlich aktivieren Sie Chronos während der Großhandelsaufnahmen, indem Sie kurze Impulse von 470 Nanometer Licht oder ChrimsonR durch kurze Impulse von 580 Nanometer Licht durch handelsübliche LEDs liefern. Die Ergebnisse zeigten, dass die ChrimsonR-Injektion zu einer starken Expression im DCN mit tdTomato-Fluoreszenz führte, die in Zellen und Fasern sichtbar ist.
Im kontralateralen ICC waren Fasern, die stark mit tdTomato gekennzeichnet waren, nach drei Wochen deutlich sichtbar, was die Fähigkeit des ChrimsonR-tdTomato-Konstrukts demonstriert, wenn es in auditive Hirnstammkerne injiziert wird. Optische Aktivierung von ChrimsonR elicted EPSPs in IC VIP Neuronen, was darauf hindeutet, dass ChrimsonR ein nützliches Werkzeug für langstreckende CRACM-Experimente ist, wenn die experimentellen Parameter die Verwendung von rotem Licht anstelle von blauem Licht erfordern. Wir stellten jedoch fest, dass ChrimsonR problemlos mit blauem Licht aktiviert wurde, was die gleiche Schwelle für die Aktivierung des Blaulichts wie Chronos anzeigte.
Für dieses Protokoll ist es am wichtigsten, sicherzustellen, dass die stereotaxic Koordinaten korrekt sind und zu bestätigen, dass das Virus nur in Ihrer Zielhirnregion exprimiert wurde. Durch den Austausch des Chronos ChrimsonR viroconstruct mit einem anderen Virus, z.B. einem zellspezifischen Flex-Virus, können Sie mehrere anatomische oder physiologische Fragen beantworten, ohne das Operationsprotokoll zu ändern.
