Marschkorallenmikroskopie Bilder enthalten Chromatic Shift in drei Dimensionen. Das beeinträchtigt die Kolokalisierungsanalyse von hochauflösenden Bildern. Es ist in der Regel schwierig, Chromatic Shift aus einer biologischen Probe selbst zu entfernen, unsere Methode kann chromatische Verschiebung in einer biologischen Probe mit separat erfassten Referenzbildern korrigieren.
Demonstrieren das Verfahren wird Takako Koujin ein Techniker aus meiner Gruppe sein. Beginnen Sie damit, 2,5 mal 10 bis zu den fünften Heilzellen auf einer 35-Millimeter-Glasbodenschale zu säen und in einem Kohlendioxid-Inkubator anzubauen. Nach 24 Stunden Inkubation das Medium durch zwei Milliliter 3,7% Formaldehyd in PBS ersetzen und schonend mischen.
Fixieren Sie den Verkauf für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform. Waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei MilliliterPBS für fünf bis zehn Minuten. Permeabilisieren Sie sie mit zwei MilliliterPunkt 1%versuchen Sie die nächsten 100 in PBS beim Drehen und wiederholen Sie die Wähme mit PBS.
Dann färben Sie die Zellen mit einem Standard-Antikörper-Färbeprotokoll, wie im Textmanuskript beschrieben. Um ein Referenzbild der Crosstalk-Referenz für die Weitfeldmikroskopie zu erhalten, fügen Sie zwei Milliliter Punkt fünf Mikrogramm pro Milliliter Dappy hinzu, um in der DNA zu bleiben. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten auf der rotierenden Plattform.
Dann ersetzen Sie die Lösung durch 100 Mikroliter Montagemedium Um ein Referenzbild der biologischen Kalibrierung Referenz für jede Art von Mikroskopie zu erhalten, einschließlich konfokale und super Auflösung Mikroskopie. Fixieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben, und bereiten Sie die Stammlösung einen fluoreszierenden Farbstoff konjugiertes Phalloidin in 1,5 Milliliter Methanol. Fügen Sie das Phalloidin in PBS bei einer Verdünnung von eins bis 100 für Alexa Boden 405 eins bis 1000 für Alexa Boden 488 und einbis 200 für Alexa Boden 594.
Fügen Sie den Zellen einen Milliliter der Lösung hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang, während sie sich drehen. Waschen Sie die Zellen drei- bis fünfmal mit zwei Millilitern PBS. Dann ersetzen Sie die PBS durch 100 Mikroliter Montagemedium.
Um Fluoreszenzbilder mittels Weitfeldmikroskopie zu erfassen, platzieren Sie die Zielprobe in der Bildgebungssoftware auf dem Mikroskop, öffnen Sie das Design- und Ausführungsfenster, stellen Sie den entsprechenden Z-Schritt ein und wählen Sie die blauen, grünen und roten Kanäle aus. Fügen Sie auf der Registerkarte Ausführen den Bilddateinamen hinzu, und beginnen Sie mit der Bildgebung. Um Übersprechenreferenzbilder zum Messen chromatischer Verschiebungen in der Probe zu erfassen, wählen Sie das Anregungslicht nur für Dappy aus und stellen Sie sicher, dass Sie genau die gleiche Bühnenposition und Z-Höhe wie für die Zielprobe verwenden.
Alternativ können Sie ein helles Feldbild als Referenzpunkt zur Zielprobe auf dem Breitfeldmikroskop verwenden und ein Fluoreszenzbild des Ziels in blauen, grünen und roten Kanälen erfassen. Dann erfassen Sie helle Feldbilder des Ziels in blauen, grünen und roten Kanälen in der exakt gleichen Bühnenposition und mit der gleichen Z-Höhe. Um Fluoreszenzbilder mit Superauflösungsmikroskopie zu erfassen, wie z. B. 3D-Sim, platzieren Sie die Zielprobe auf dem Mikroskop und erfassen Sie ein Fluoreszenz-Sim-Bild des Ziels in blauen, grünen und roten Kanälen.
Rekonstruieren Sie dann das super aufgelöste Bild. Als nächstes legen Sie den Probenfleck mit mehrfarbigem Phalloidin auf ein 3D-Simmikroskop. Und erfassen Sie mehrere Fluoreszenz-Sim-Bilder als biologische Kalibrierreferenzbilder an Punkt-Stufenpositionen, und rekonstruieren Sie dann die super aufgelösten Bilder.
Verwenden Sie einen Webbrowser, um die neueste binäre Version von Chromagnon herunterzuladen. Extrahieren Sie das Programm und legen Sie die ausführbare Datei an einem geeigneten Speicherort ab. Ziehen Sie die Referenzdateien von Crosstalk-Rechtenfeldern oder biologischen Kalibrierreferenzen in das Referenzfeld, und legen Sie sie ab, oder klicken Sie auf Referenzdateien, um ein Dialogfeld für die Dateiauswahl zu öffnen.
Wenn das Programm darum bittet, ein Java Development Kit zu installieren, drücken Sie Ja, und navigieren Sie zur heruntergeladenen Seite. Laden Sie dann das JDK für das Betriebssystem herunter und installieren Sie es wie angewiesen. Ziehen Sie die Zieldateien der Antikörperfärbung in das Zielfeld und legen Sie sie ab.
Wählen Sie ein Ausgabebildformat aus, und geben Sie das Suffix für den Dateinamen der Ausgabe an. Für Crosstalk-Referenzbilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Wählen Sie Projektion aus der Auswahlliste der lokalen Ausrichtung und verwenden Sie eine minimale Fenstergröße von 60.
Für mehrere biologische Kalibrierreferenzbilder überprüfen Sie die Option Durchschnittliche Referenzen Und wählen Sie keine für lokale Ausrichtung, und klicken Sie dann auf Alle ausführen, um die Messungen zu starten. Um sicherzustellen, dass die Messung korrekt durchgeführt wurde, ziehen Sie die Referenzbilder in das Referenzfeld und das Zielfeld. Führen Sie dann das Programm aus und stellen Sie sicher, dass die Bilder perfekt überlappen.
Die chromatische Schichtkorrektur in der Weitfeldmikroskopie kann mit einem Crosstalk-Referenzbild durchgeführt werden. Dieses Bild wurde mit einem Weitfeldmikroskop mit einer einzigen Kamera erstellt. Fluoreszenzemission von Dappy wurde als Referenz verwendet, um die blauen, grünen und roten Kanäle zu korrigieren.
Nach der Ausrichtung mit Chromagnon wurde die Chromatische Verschiebung und das Referenzbild korrigiert. Wenn der Ausrichtungsparameter von Chromagnon auf das Zielbild angewendet wurde, zeigten sich die DNA und die Anaphasenbrücke, die außerhalb der Kernhülle falsch gesehen wird, bevor die Ausrichtung wie erwartet innerhalb der Hülle angezeigt wird. Chromatische VerschiebungSkorrektur eines 3D-Simbildes kann mit einem biologischen Kalibrierreferenzbild durchgeführt werden.
Drei 3D-Sim-Bilder von HeLa-Zellen, die mit Phalloidinen befleckt sind, die zu blauen, grünen und roten Farbstoffen konjugiert sind, wurden verfeinert und die Chromatische Verschiebung wurde von Chromagnon gemessen. Nach der Ausrichtung wurde die Chromatische Verschiebung und das Referenzbild korrigiert. Der Ausrichtungsparameter wurde auf ein Zielbild angewendet.
Die XZ-Ansicht zeigt eine falsche Kanalposition entlang des Z und leicht entlang der X-Richtungen, die nach der Ausrichtung korrigiert wurde. Für eine optimale Leistung ist es wichtig, Referenzbilder unter den gleichen Bedingungen und dem Timing wie ein Zielbild zu erhalten.
