Meine Arbeitsgruppe befasst sich mit der grundlegenden Molekularbiologie und Biochemie von biosynthetischen Fließbändern in Bakterien. Unser Ziel ist es, Bakterien so zu entwickeln, dass sie neue Antibiotika herstellen. Wir sind leidenschaftlich daran interessiert, diese Arbeit in den Unterricht zu bringen und den Schülern praktische Erfahrungen mit modernsten Techniken in der Biotechnologie zu vermitteln.
Topoisomerase-basiertes Klonen wird derzeit im Molekularbiologie-Unterricht der Cal Poly eingesetzt, um Studenten in das molekulare Klonen einzuführen. Gibson Assembly hat sich zu einer industriell relevanten molekularen Klonierungstechnik entwickelt, und wir versuchen, den Studenten anwendbare Erfahrungen zu vermitteln. Molekulares Klonen ist eine Technik, die in einem traditionellen Bachelor-Unterricht schwierig zu konzipieren sein kann.
Wir haben ein praxisorientiertes Labormodul konzipiert, in dem die Studierenden ihr Experiment entwerfen und auswerten sowie an authentischen Forschungsprojekten mitwirken. Dies verbessert ihr Verständnis für den Klonierungsprozess und die Anwendungen ihrer Arbeit. Während andere kursbasierte Forschungserfahrungen im Grundstudium mit molekularen Klonierungstechniken veröffentlicht wurden, enthält keine ein anpassungsfähiges Gibson-Assemblierungsmodul.
Wir haben alle Materialien so konzipiert, dass sie die Lernergebnisse für diese kursbasierte Forschungserfahrung im Grundstudium messen. Wir hoffen, dass dies als leicht zu implementierendes Instrument für die wissenschaftliche Bildung dienen wird, um die Bewertung der Dozenten und die Ausbildung der Studenten in molekularbiologischen Laboratorien auf Hochschulniveau zu verbessern. Bestimmen Sie zunächst die DNA-Template-Quelle für die Geninsertionen, z. B. genomische DNA, Plasmide oder synthetische DNA.
Rufen Sie die DNA-Sequenzen der Geninsertionen und des Vektors ab. Importieren Sie die gewünschten Insert-Sequenzen und Vektorsequenzen als neue DNA-Sequenzdateien in Benchling. Öffnen Sie dann jede importierte Sequenz, die in der Gibson-Assemblierungsreaktion verwendet werden soll.
Suchen Sie nun das Werkzeug Montageassistent am unteren Rand des Bildschirms. Klicken Sie auf Baugruppen-Assistent, und wählen Sie dann Neue Baugruppe erstellen aus. Wählen Sie aus den verfügbaren Optionen Gibson aus, und klicken Sie auf Start, um mit der Montage zu beginnen.
Wählen Sie im Fenster Vektorsequenz die Vektor-Rückgratbasen aus, beginnend mit den 3 Primzahlen des Geninserts bis zum gewünschten Endpunkt. Klicken Sie nach der Auswahl auf die Registerkarte Backbone am unteren Bildschirmrand und wählen Sie Fragment festlegen aus. Wählen Sie im Fenster Einfügesequenz alle Einfügebasen aus, die in die Baugruppe aufgenommen werden sollen.
Klicken Sie nach der Auswahl auf die Registerkarte Einfügen am unteren Bildschirmrand und wählen Sie Fragment festlegen aus. Wenn mehrere Geninsertionen vorhanden sind, klicken Sie auf die Plus-Schaltfläche auf der rechten Seite des Assemblierungs-Assistenten. Wählen Sie im Fenster Einfügesequenz alle Basen für die zusätzliche Einfügung aus, die in die Baugruppe aufgenommen werden soll.
Klicken Sie nach der Auswahl auf die Registerkarte Einfügen am unteren Bildschirmrand und wählen Sie Fragment festlegen aus. Nachdem alle Fragmente festgelegt sind, benennen Sie die Assemblierung in den gewünschten Plasmidnamen um. Klicken Sie auf der rechten Seite des Montage-Assistenten auf Einbau.
Wählen Sie dann den gewünschten Ordnerspeicherort sowohl für den Sequenzordner als auch für den Primerordner aus und klicken Sie auf Erstellen, um die rekombinante Plasmidsequenz zusammenzusetzen. Öffnen Sie nun das assemblierte Plasmid und klicken Sie auf Assemblierungsverlauf, um eine grundlegende Plasmidkarte und eine Übersicht über die Sequenzen anzuzeigen, von denen es abgeleitet wurde. Zeigen Sie auf der Registerkarte Baugruppenparameter die Namen der Primer an, die für die Baugruppe entworfen wurden.
Vergewissern Sie sich, dass für jedes Insert zwei Primer vorhanden sind und dass die Primernamen von den Titeln der DNA-Sequenzdateien abgeleitet werden. Stellen Sie sicher, dass die Schmelztemperaturen der Grundierung und die empfohlenen Glühtemperaturen kompatibel sind. Sobald das Primer-Design für die gewünschten Plasmide abgeschlossen ist, klicken Sie im Montage-Assistenten auf Abschließen.
Unter Verwendung eines Gradienten-PCR-Experiments mit den DNA-Templates werden sowohl Insert- als auch vektorspezifische Primerpaare auf optimale Annealing-Temperaturen getestet. Sobald die Glühtemperaturen bestimmt wurden, erstellen Sie Aliquots von Primerlösungen, DNA-Templates und notwendigen Reagenzien für PCR-Reaktionen für Studenten. Besorgen Sie sich zunächst Primer und DNA-Template-Lösungen für die PCR vom Dozenten.
Bereiten Sie mit den hier gezeigten Reagenzien 25-Mikroliter-PCR-Reaktionen vor, um lineare Fragmente der gewünschten DNA-Sequenzen zu erhalten. Durchlaufen Sie die Reaktion in einem Thermocycler. Stellen Sie sicher, dass die Glühtemperatur für die Primer geeignet ist und dass die Verlängerungszeit für die Länge des gewünschten Amplikons geeignet ist.
Analysieren Sie als Nächstes fünf Mikroliter jeder Reaktion mittels Agarose-Gelelektrophorese. Während das Gel läuft, fügen Sie jeder Reaktion, bei der Plasmid-DNA als Matrize verwendet wird, einen Mikroliter DpnI-Restriktionsenzym hinzu. Inkubieren Sie diese Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.
Nehmen Sie dann ein Bild des Gels ab, um zu bestätigen, dass die PCR erfolgreich war und eine korrekte Amplifikation erreicht wurde. Reinigen Sie alle erfolgreichen PCR-Reaktionen mit einem kommerziell erhältlichen PCR-Aufreinigungskit. Messen Sie die Konzentration des gereinigten PCR-Produkts mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer zur Verwendung in nachfolgenden Gibson-Assemblierungsberechnungen.
Pipettieren Sie die Reaktionskomponenten der Gibson-Baugruppe. Inkubieren Sie die Reaktion 15 Minuten lang bei 50 Grad Celsius. Während die Reaktionen inkubieren, tauen chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen auf Eis zur Umwandlung auf.
Wandeln Sie zwei Mikroliter der Gibson-Assemblierungsreaktion durch einen Hitzeschock in chemisch kompetente Zellen um. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der transformierten Zellen auf zwei Selektionsplatten und verteilen Sie sie mit sterilisierten Kügelchen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag lagerst du die Platte bei vier Grad Celsius. Zählen Sie dann die Kolonien auf allen Platten und berechnen Sie die Transformationseffizienz mit der angegebenen Formel. Wählen Sie mit einem Marker vier verschiedene Kolonien auf der Auswahltafel aus und beschriften Sie sie mit den Initialen des Schülers und einer Nummer.
Nehmen Sie eine neue LB-Agar-Platte mit Antibiotika zur Selektion und teilen Sie sie in Quadranten ein. Verwende etwa die Hälfte jeder Kolonie, um auf den jeweiligen Quadranten zu reaken. Geben Sie die richtige Antibiotikakonzentration in die Röhrchen, die zur Auswahl mit der Kolonieidentität gekennzeichnet sind.
Beimpfen Sie dann eine Fünf-Milliliter-Flüssig-LB-Kultur mit der anderen Hälfte jeder der vier ausgewählten Kolonien. Inkubieren Sie die Flüssigkulturen über Nacht in einem Schüttelbrutator bei 37 Grad Celsius und die Agarplatte in einem statischen Inkubator bei der gleichen Temperatur. Isolieren Sie Plasmid-DNA aus den Flüssigkulturen mit einem Mini-Vorbereitungskit.
Messen Sie die Konzentration der isolierten Plasmid-DNA in Nanogramm pro Mikroliter. Nachdem Sie ein Restriktionsverdau-PCR-Screening zur Analyse der isolierten Plasmide entwickelt haben, pipettieren Sie die Restriktionsverdaureaktionen oder PCR-Reaktionen. Analysieren Sie dann die Ergebnisse durch Gelelektrophorese.
Sobald das Gibson-Assembly-Modul abgeschlossen ist, bitten Sie die Teilnehmer, den Multiple-Choice-Fragebogen nach dem Ausfüllen in der Laborbesprechung auszufüllen. Kombinieren Sie alle Daten aus den Antworten vor und nach dem Fragebogen für die Analyse und bewerten Sie ihre statistische Signifikanz. Nach dem Projekt stieg die durchschnittliche Punktzahl signifikant von 63,7 % auf 80,4 % an, was auf ein verbessertes Verständnis der Schüler für Molekularbiologie und Klonierungskonzepte hindeutet.
Die durchschnittliche Termkonfidenz stieg signifikant von 3,52 auf 3,87, wobei eine große Effektgröße ein verbessertes Verständnis der Schüler für molekularbiologische Begriffe zeigte. Das Vertrauen des durchschnittlichen Studenten in die Durchführung von Labortechniken stieg signifikant von 3,82 auf 4,33, was eine verbesserte Vertrautheit mit molekularbiologischen Techniken zeigt. Die Anzahl der Antworten, die auf eine Vertrautheit mit dem Begriff Gibson-Assemblierung hindeuteten, stieg von vor und nach dem Fragebogen signifikant an, wobei die Zahl derjenigen, die den Begriff erklären konnten, deutlich zunahm.
Das Vertrauen in die Durchführung der Gibson-Assemblierungstechnik verbesserte sich mit den meisten Antworten und wechselte von neutral oder nicht einverstanden vor der Sitzung zu Zustimmung oder starker Zustimmung nach der Sitzung. Das Vertrauen der Schülerinnen und Schüler in allgemeine Biologiethemen zeigte keine statistisch signifikanten Veränderungen. Im Gegensatz dazu stieg das Vertrauen in spezielle Gibson-Montagefragen deutlich an.
