Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos

Resumen

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Resumen

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis ¹ or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers ^2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.

The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Introducción

Debido al creciente uso del oro para diversas aplicaciones como la electrónica, catalizadores, biosensores, o instrumentos médicos, la demanda de este metal precioso ha crecido en los últimos pocos años ^6-9. Oro, así como muchos otros metales preciosos y pesados ​​se liberan en el medio ambiente a través de efluentes industriales en concentraciones diluidas, a través de las actividades mineras, y la eliminación de residuos ^7,8,10, aunque la mayor contaminación ambiental por metales pesados ​​o preciosos es un proceso en curso causado principalmente por las actividades tecnológicas. Esto conduce a una interferencia significativa de los ecosistemas naturales y potencialmente podría amenazar la salud humana ^9. Conocer estos resultados negativos promueve la búsqueda de nuevas técnicas para eliminar los metales de los ecosistemas y las mejoras en el reciclaje de metales contaminados por las aguas residuales industriales. Métodos físico-químicos bien establecidos como precipitación o intercambio de iones no son tan eficaces, especialmente en altoly diluye soluciones ^7,8,11. Biosorción, ya sea con la vida o la biomasa muerta, es una alternativa atractiva para el tratamiento de aguas residuales ^10,12. El uso de tales materiales biológicos puede reducir el consumo de productos químicos tóxicos. Muchos microorganismos se han descrito para acumular o inmovilizar metales. Por ejemplo, las células de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 han demostrado capacidades de unión altos para los metales preciosos, por ejemplo, Pd (II), Pt (II), Au (III), y otros metales tóxicos como el Pb (II) o U (VI) ^4,13, las células de Bacillus megaterium para Cr (VI) ^14, las células de Saccharomyces cerevisiae para Pt (II) y Pd (II) ^15, y Chlorella vulgar para Au (III) y U (VI) ^{16 , 17.} La unión de los metales anteriores como Au (III), Pd (II) y Pt (II) también se ha informado de Desulfovibrio desulfuricans ¹⁸ y para L. sphaericus JG-B53 ^19,20. Sin embargo, no all microbios unen altas cantidades de metales y su aplicación como material de sorción es limitada ^12,21. Además, la capacidad de unión a metal depende de diferentes parámetros, por ejemplo, la composición celular, la bio-componente utilizado, o ambientales y las condiciones experimentales (pH, fuerza iónica, temperatura, etc.). El estudio de los fragmentos de pared celular aisladas ^22,23, como los lípidos de membrana, peptidoglicano, proteínas u otros componentes, ayuda a entender el metal procesos de células enteras construidas complejas ^8,21 vinculante.

Los componentes de la célula se centraron en en este estudio son las proteínas de la capa S. Proteínas de la capa S son partes de la envoltura celular externa de muchas bacterias y arqueas, y que constituyen aproximadamente el 15 - 20% de la masa total de proteínas de estos organismos. A medida que la primera interfaz para el medio ambiente, estos compuestos celulares influyen fuertemente en las propiedades de sorción ³ bacterianas. Proteínas de la capa S con pesos moleculares que van desde los cuarentaa cientos de kDa se producen dentro de la célula, pero se ensamblan exterior, donde son capaces de formar capas en las membranas de lípidos o componentes de la pared celular poliméricos. Una vez aislado, casi todos los S-capa proteínas tienen la propiedad intrínseca de auto-ensamblan espontáneamente en suspensión, en las interfaces, o en superficies planas que forman o estructuras similares a tubos ^3. El espesor de la monocapa de la proteína depende de la bacteria y se encuentra dentro de una gama de 5 - 25 nm ^24. En general, las estructuras de las proteínas S-capa formada pueden tener un oblicua (P1 o P2), cuadrada (p4), o hexagonal (p3 o p6) simetría con constantes de red de 2,5 a 35 nm ^3,24. La formación de celosía parece ser en muchos casos dependientes de cationes divalentes y principalmente en Ca ^{2+ 25,26, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2}016 (presentado)). Sin embargo, la cascada de la reacción completa de plegado monómero, la interacción monómero-monómero, la formación de un enrejado, y el papel de diferentes metales, especialmente de cationes divalentes tales como Ca ^{2+ y} Mg ^2+, todavía no se entiende completamente.

La cepa grampositivos L. sphaericus JG-B53 (renombrado de Bacillus sphaericus después de nueva clasificación filogenética) ²⁷ se aisló de la minería del uranio pila de residuos "Haberland" (Johanngeorgenstadt, Sajonia, Alemania) ^4,28,29. Su proteína S-capa funcional (SLP1) posee una red cuadrada, un peso molecular de 116 kDa ^30, y un espesor de 10 nm sobre ≈ células de las bacterias que viven ^31. En estudios anteriores, la formación in vitro de una capa de proteína cerrado y estable con un espesor de aproximadamente 10 nm se logró en menos de 10 min ^19. La cepa relacionada L. sphaericus JG-A12, también un aislamiento de la pila "Haberland", posee capacidades de unión de alta de metal y su proteína aislada S-capa ha mostrado buenos índices de absorción alta estabilidad química y mecánica y para los metales preciosos como el Au (III), Pt (II), y Pd (II) ^4,32,33. Esta unión de los metales preciosos es más o menos específica para algunos metales y depende de la disponibilidad de grupos funcionales en la proteína de superficie exterior e interior del polímero y en sus poros, la fuerza iónica, y el valor pH. Grupos funcionales relevantes para la interacción de metal por las proteínas son _COOH, NH2 -, OH-, PO ₄ -, _SO 4 - y SO. En principio, la capacidad de unión a metal abren un amplio espectro de aplicaciones, ^{Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)).} por ejemplo, como componentes biosorptive para la eliminación o la recuperaciónde metales tóxicos o valiosos disueltos, plantillas para la síntesis o deposición definido de nanopartículas estructuradas regularmente metálicos (NPS) para la catálisis y otros materiales de bioingeniería como capas bio-sensorial ^3,5,18,33. Arrays NP dispuestos regularmente como Au (0) -NPs podrían ser utilizados para las principales aplicaciones que van desde la electrónica molecular y biosensores, dispositivos de almacenamiento de densidad ultra alta, y catalizadores para la oxidación de ^CO-34-37. El desarrollo de este tipo de aplicaciones y el diseño inteligente de estos materiales requiere una comprensión más profunda de los mecanismos de unión de metales subyacentes.

Un requisito previo para el desarrollo de tales materiales de origen biológico es la implementación fiable de una capa de interfaz entre la biomolécula y la superficie técnica ^38,39. Por ejemplo, polielectrolitos ensamblan con la capa por capa (LBL) ^40,41 técnica se han utilizado como una capa de interfaz para la recristalización de las proteínas de la capa ^S-39 . Tal interfaz ofrece una forma relativamente fácil de realizar el recubrimiento de proteína de una manera reproducible y cuantitativa. Mediante la realización de diferentes experimentos con y sin modificación con promotores adhesivos, es posible hacer declaraciones con respecto a la cinética de revestimiento, la estabilidad de la capa, y la interacción de los metales con biomoléculas ^{19,42, Raff, J. et al. S-capa de nanocompuestos basados ​​en aplicaciones industriales en a base de proteína Engineered Nanoestructuras. (eds Tijana Z. Grove y Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (presentado)).} Sin embargo, el complejo mecanismo de la adsorción de proteínas y la interacción proteína-superficie no se entiende completamente. Especialmente información sobre la conformación, la orientación de patrones, y densidades de recubrimiento sigue desaparecido.

Cuarzo microbalanza de cristal con el monitoreo de disipación (QCM-D) técnica ha llamado la atención en los últimos años como una herramienta para el estudio de la adsorción de proteínas, la cinética de revestimiento, y la interacción proprocesos en la escala nanométrica ^19,43-45. Esta técnica permite la detección detallada de la adsorción de masas en tiempo real, y se puede utilizar como un indicador para el proceso de auto-montaje de proteínas y el acoplamiento de moléculas funcionales en redes de proteínas ^{19,20,42,46-48.} Además, las mediciones QCM-D abren la posibilidad de estudiar los procesos de interacción de metal con la capa proteínica en condiciones biológicas naturales. En un estudio reciente, la interacción de la proteína S-capa con metales seleccionados como Eu (III), Au (III), Pd (II) y Pt (II) se ha estudiado con QCM-D ^19,20. La capa de proteína adsorbida puede servir como un modelo simplificado de una pared celular de las bacterias gram-positivas. El estudio de este componente único puede contribuir a una mayor comprensión de la interacción metal. Sin embargo, únicamente los experimentos QCM-D no permiten declaraciones con respecto a las estructuras superficiales y las influencias de los metales a la proteína. Otras técnicas son necesarias para obtener dicha información. Uno posbilidad de imágenes bio-nanoestructuras y la obtención de información sobre las propiedades estructurales es la microscopía de fuerza atómica (AFM).

El objetivo del estudio presentado fue investigar la sorción de oro (Au (III) y Au (0) -NPs) a las proteínas de la capa S, en particular SLP1 de L. sphaericus JG-B53. Los experimentos se realizaron con las proteínas en suspensión en la escala de proceso por lotes en un intervalo de pH de 2,0 - 5,0 usando ICP-MS y con S-capas inmovilizadas utilizando QCM-D. Además, la influencia de la solución de sal de metal sobre la estabilidad de celosía se investigó con los estudios de AFM posteriores. La combinación de estas técnicas contribuye a una mejor comprensión de los procesos de interacción in vitro de metal en como una herramienta para aprender más acerca de los acontecimientos en las células bacterianas enteras respecto afinidades metálicos específicos vinculante. Este conocimiento no sólo es crucial para el desarrollo de materiales de filtración aplicables para la recuperación de metales para la protección ambiental y la conservación de la re⁴⁹ fuentes, sino también para el desarrollo de matrices de NPs metálicas altamente ordenadas para diversas aplicaciones técnicas.

Protocolo

1. Los microorganismos y Condiciones de cultivo

Nota:. Todos los experimentos se realizaron en condiciones estériles L. sphaericus JG-B53 se obtuvo de una cultura crio-conservado ^29,30.

1. Cultura (1,5 ml) en la mesa de trabajo limpia Transferencia crio-conservados a 300 ml de caldo nutriente estéril (NB) medios de comunicación (extracto de carne 3 g / l, 5 g / L de peptona, 10 g / L de NaCl). Después se agita la solución durante al menos 6 horas a 30 ° C para obtener el pre-cultivo para el cultivo.
2. Cultivar las bacterias en condiciones aeróbicas en medios NB a pH = 7,0, 30 ° C en un 70 L escalado biorreactor de vapor en el lugar. Por lo tanto, llenar el reactor con ≈ 57 l de agua desionizada. Añadir y disolver medios NB sólida directamente en biorreactor (concentraciones véase más arriba).
   1. Adicionalmente añadir agente antiespumante (30 l / L NB-medios de comunicación) a los medios para suprimir la formación de espuma durante el cultivo, a continuación, el autoclave (122 ° C, temperatura de mantenimiento de tiempo de 30 min) los medios de comunicacióndentro de la instalación del reactor.
3. Enfriar los medios de comunicación y realizar completa saturación de oxígeno. Ajustar el pH a 7,0 (usando 1 MH ₂ SO ₄ y 2 M de NaOH) e iniciar la inoculación automático de los 300 ml de precultivo. Iniciar el registro de datos de los parámetros de cultivo en el punto de inoculación. Entrar los parámetros en línea, por ejemplo, el nivel de oxígeno disuelto (OD _2), además de ácido y base, y valores de pH en el cultivo.
   1. Monitorear el crecimiento bacteriano en línea por las mediciones de turbidez no invasivos.
4. Realizar un muestreo adicional después de cada hora de cultivo y determinar con mayor precisión los parámetros como el peso bio seco (BDW) y la densidad óptica en línea (OD). Por lo tanto, recoger 20 ml de caldo de cultivo en cada punto de muestreo en condiciones estériles.
   1. Determinar offline OD por mediciones fotométricas de la adsorción a 600 nm. Utilice NB-medio filtrado estéril como un valor en blanco. En popaer llegar adsorción> 0,4 ​​diluido la suspensión celular después de la linealidad de la ley de Lambert-Beer.
   2. Para la determinación de BDW centrífuga de 1 a 5 ml de suspensión bacteriana (dependiendo de la densidad celular) a 5000 xg durante 5 min a TA. Secar el pellet celular obtenido a 105 ° C en un horno de calentamiento hasta la estabilidad en masa y medir la masa de pellets.
5. Tomar imágenes microscópicas con microscopio de fase óptica investigación contraste en 400 y 1000 veces de ampliación (contraste de fase de condensador 2 y 3, respectivamente) para el control del crecimiento bacteriano y como un control de la contaminación cruzada.
6. Después de alcanzar la fase de crecimiento exponencial detectada por línea no ₂ y la turbidez en línea, la cosecha de la biomasa por centrifugación de flujo continuo a 15.000 xg, 4 ° C y se lava la biomasa dos veces con tampón estándar (mM TRIS 50 mM de MgCl 10 _2, 3 mM NaN _3, pH = 7,5).
   Nota: El sedimento biomasa obtenida se puede almacenar a -18 & #176; C hasta nuevo uso para el aislamiento.

2. S-capa Aislamiento y Purificación de Proteínas

Nota: Se purifica polímeros SLP1 de acuerdo con un método adaptado como se describió anteriormente ^{2,19,30,32,50,51.}

1. Homogeneizar la biomasa crudo lavado y descongelada obtenida a partir de cultivo en tampón estándar (1: 1 (w / v)) para eliminar los flagelos mediante el uso de un dispersor (nivel 3, 10 min) bajo enfriamiento baño de hielo a 4 ° C.
2. Centrifugar la suspensión (8.000 xg, 4 ° C durante 20 min) y lavar el sedimento obtenido dos veces con tampón estándar (1: 1 (w / v)). Después del lavado y centrifugación (8.000 xg, 4 ° C durante 20 min), resuspender el precipitado en tampón estándar (1: 1 (w / v)), añadir la ADNasa II y RNasa (0,4 unidades / g de biomasa) a la suspensión y se desintegran las células a 1.000 bar con un homogeneizador de alta presión. Después se centrifuga la suspensión a 27.500 xg, 4 ° C durante 1 hr.
   Nota: suspensión de células de control con los mi de investigacióncroscope. La ruptura se completa cuando menos de 2 - 3 células intactas son visibles en el campo de visión del microscopio en 400 veces magnificación.
3. Lavar el sedimento dos veces con tampón estándar (1: 1 (w / v)) y realizar la centrifugación de nuevo. Después resuspender el precipitado en tampón estándar (2: 1 (w / v)) mezclado con 1% de Triton X-100 y se incuba durante 20 min bajo sucesiva agitación (100 rpm) para solubilizar depósitos de lípidos.
4. Centrifugar la solución (27.500 xg, 4 ° C durante 1 hr) y lavar los pellets obtenidos tres veces con tampón estándar (1: 1 (w / v)).
5. Incubar el sedimento obtenido después de la centrifugación adicional (27.500 xg, 4 ° C durante 1 hr) durante 6 horas en tampón estándar (1: 1 (w / v)) mezclado con 0,2 g / L de lisozima, para hidrolizar enlaces en peptidoglicano ^50. Añadir Además DNasa y RNasa II (cada uno 0,4 unidades / g de biomasa) a la suspensión.
6. Después de la centrifugación (45.500 xg, 4 ° C, 1 hora), volver a suspender la fase de proteína de clara superior con un bajo volumen de tél sobrenadante de la centrifugación (<30 ml) que contienen subunidades de proteínas.
7. Solubilizar la suspensión blanca mezclando 1: 1 con 6 M clorhidrato de guanidina (6 M GuHCl, 50 mM TRIS, pH = 7,2). La solución se vuelve brillante.
8. Realizar la filtración estéril (0,2 micras) de la solución tratada GuHCl seguido de una centrifugación a alta velocidad adicional (45.500 xg, 4 ° C durante 1 hr).
9. Transferir el sobrenadante a tubos de membrana de diálisis (MWCO 50.000 Dalton) y se dializó frente a tampón que recristalización (1,5 mM TRIS, 10 mM CaCl _2, pH = 8,0) durante 48 horas.
10. Transferir la solución de polímero proteína recristalizada blanco en tubos y se centrifuga a 45.500 xg, 4 ° C durante 1 hora. Resuspender el precipitado en un bajo volumen de agua ultrapura (<30 ml).
11. Después, transferir la suspensión en tubos de membrana de diálisis y realizar una diálisis contra agua ultrapura durante 24 horas para eliminar el contenido del búfer.
    Nota: Varios cambios de tampón o agua ultrapura durante la diálisis son indispensables.
12. Liofilizar la SLP1 purificado en un liofilizador.

3. Caracterización y cuantificación de SLP1 para experimentos

Nota: concentración SLP1 de sorción y revestimiento experimentos se cuantificó por espectrofotometría UV-VIS.

1. Pipetear 2 l de muestra disuelta SLP1 directamente sobre el pedestal de medición inferior del fotómetro. Determinar la concentración de proteína a la máxima adsorción a una longitud de onda de 280 nm, característico de las proteínas. Utilice el coeficiente de extinción de 0,61 para determinar la concentración SLP1. Utilice SLP1 solución gratuita para mediciones de referencia.
2. Diluir la proteína con el tampón (para los experimentos de sorción en modo por lotes utilizan 0,9% de NaCl, pH = 6,0 y para los experimentos QCM-D utilizan tampón de recristalización, pH = 8,0) a la concentración deseada para experimentos (1 g / L y 0,2 g / L respectivamente).
3. Analizar la calidad SLP1 y el peso molecular por el Bioanal estándarelectroforesis ytical método de sodio dodecil sulfato poliacrilamida (SDS-PAGE) descrito por Laemmli, UK ^52.
   1. Realizar SDS-PAGE antes de usar SLP1 dentro experimentos y, por ejemplo, después de Au (0) incubación -NP usando 10% en geles de poliacrilamida de separación.
   2. Por SDS-muestras mezcla ≈10 l de la muestra de cultivo o la proteína con tampón de muestra (1,97 g TRIS, 5 mg de azul de bromofenol, 5,8 ml de glicerina, 1 g de SDS, 2,5 ml β-mercaptoetanol, se llenan de agua ultrapura a 50 ml) en una proporción de 1: 1 (v / v) y la pipeta la mezcla después de 4 minutos de incubación a 95 ° C en los bolsillos de gel.
   3. Run SDS-PAGE 30 min a una tensión de 60 V hasta que las muestras pasan la tensión de gel de colección y el cambio a 120 V, una vez que pasa el gel de separación.
   4. Retire los geles del sistema de gel, enjuague con agua ultrapura y lugar durante 1 hora en una solución de fijación (ácido ácida 10%, 50% de etanol absoluto). Después, enjuague los geles con agua ultrapura.
   5. Geles Stainutilizando una coloidal no específica adaptada Coomassie brillante método de ^53,54 azul. Después de decoloración ^72,73, tomar imágenes de SDS-PAGE por el sistema de documentación de gel de acuerdo con el protocolo del fabricante.

4. Los experimentos de sorción en el modo por lotes y cuantificación de metales

1. Para el lote experimentos de sorción preparan Au solución madre (III) a partir de _HAuCl4 ∙ 3 H ₂ O, diluir la sal de metal y se mezcla con la solución SLP1 / NaCl a una concentración de metal inicial de 1 mM y concentración final SLP1 de 1 g / L . Realizar experimentos en tríos con un control negativo adicional sin SLP1. Utilizar un volumen total de 5 ml para los experimentos de sorción.
2. Agitar la suspensión continuamente a RT a diferentes valores de pH pre-ajustado entre 2,0 a 5,0 durante 24 horas (ajustar el pH con solución de HCl y NaOH concentrado bajo).
3. Después de la adsorción, centrifugar las muestras a 15.000 xg, 4 ° C durante 20 min) para la SEPARcomió SLP1 del sobrenadante.
4. Transferir el sobrenadante a tubos de ultrafiltración (MWCO 50.000 Da) y se centrifuga a 15.000 xg este, 4 ° C durante 20 min para eliminar los monómeros de proteínas disueltas.
5. Determinar la concentración de metal en el filtrado resultante por ICP-MS ^19,20 y utilizar los resultados para back-cálculo de sorbido metal mediante la masa seca SLP1. Principios de medición, las oportunidades del método y los componentes de la segunda mano ICP-MS fueron descritos en la literatura ^55.
   1. Preparar muestras y referencias para las mediciones de ICP-MS utilizando 1% HNO ₃ como matriz y el rodio como patrón interno (1 mg / ml).

5. Síntesis de Au-NP y Determinación del Tamaño de Partículas

Nota: Citrato estabilizado Au (0) -NP se sintetizaron de acuerdo con un método adaptado descrito previamente por Mühlpfordt, H. et al. (1982) para obtener partículas esféricas con un diámetro de 10 - 15 nm ^56,57 .

1. Preparar un estabilizado mM HAuCl 25 ₄ ∙ 3 H ₂ O stock para la formación NP.
2. Diluir 250 ml de esta solución madre en 19.75 ml de agua ultrapura y se incuba estos a 61 ° C durante 15 min bajo sucesivas sacudidas.
3. Preparar 5 ml de una segunda solución madre (12 mM de ácido tánico, 7 mM de citrato de sodio dihidrato, 0,05 mM de K ₂ CO ₃₎ y se incuba la solución 2 ^nd por separado a 61 ° C durante 15 min.
4. Añadir bajo constante agitación de la solución madre ² al solución única. Se agita la mezcla de reacción durante al menos 10 minutos a 61 ° C. Luego enfriar la solución y utilizarla para recubrimiento NP en SLP1 celosía dentro experimentos QCM-D.
   Nota: El Au resultante (0) -NP se caracterizaron con espectroscopía UV-VIS en el máximo de absorbancia de 520 nm, típicamente utilizado para la detección de formado Au (0) -NPs ^58. La solución puede ser almacenada a 4 ° C.
5. Analizar el tamaño de la formadaAu (0) -NP por espectroscopia de correlación de fotones (PCS), que también se conoce como dispersión de luz dinámica.
   1. Para la determinación del tamaño de la NP, transferir 1,5 ml de sintetizado Au (0) -NP solución en cubetas bajo condiciones libres de polvo en una caja de flujo laminar y analizarlo con un tamaño y potencial zeta medidor de partículas. Una descripción detallada de PCS y preparación de la muestra se da en Schurtenberger, P. et al. (1.993) ⁵⁹ y Jain, R. et al. (2015) ^60.

6. Los experimentos QCM-D - SLP1 Recubrimiento de Superficies y Au-NP adsorción en SLP1 Entramado

Nota: Las mediciones se llevaron a cabo con un QCM-D equipado con hasta cuatro módulos de flujo. Todos los experimentos QCM-D se realizaron con un caudal constante de 125 l / min a 25 ° C. Recubrimiento SLP1 y metal incubación / NP se realizaron en SiO sensores de cuarzo AT-corte ₂ piezoeléctricos (Ø 14 mm) con una frecuencia fundamental de ≈ 5 MHz. Enjuague pasos y añadirition de solución están marcados en las figuras de los resultados de parte representativa. Los experimentos QCM-D podría ser descrito como un paso a modo paso comenzando con la limpieza y la modificación de la superficie de los sensores utilizados, seguido de recristalización SLP1 y más tarde en la interacción NP metal y metal.

1. Procedimientos de limpieza:
   1. Equipar las células del líquido con maniquíes de sensores. Bomba de al menos 20 ml (cada uno por módulo) de un agente de limpieza líquido alcalino (2% limpiador en agua ultrapura (v / v)) a través del sistema QCM-D y el tubo. Después bombear el volumen de cinco veces (cada uno por módulo) de agua ultrapura a través del sistema (caudal de hasta 300 l / min). Realizar la limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   2. Limpiar los SiO _{2 sensores} fuera de los módulos de flujo por incubación (al menos 20 min) en solución de SDS al 2% y enjuagar los sensores después varias veces con agua ultrapura ^61,62.
   3. Seque los cristales con un borrador filtradaressed aire y colocarlos en una cámara de limpieza de ozono durante 20 minutos ^63,64.
   4. Repita el procedimiento de limpieza dos veces para eliminar todos los contenidos orgánicos.
   5. Para eliminar los metales ligados desde la superficie del sensor enjuague los sensores con 1 M HNO _3. Después, realice todos los pasos de enjuague con agua ultrapura.
2. Sensor modificación de la superficie por polielectrolitos:
   Nota: la modificación de la superficie se puede hacer ya sea en el interior (fluya a través de procedimiento) o fuera del módulo de flujo (técnica LbL). Dentro de estos experimentos se utilizó la siguiente forma para modificar las superficies.
   1. Modificar los sensores con 3 g / l de capas alternas de educación física de polietilenimina (PEI, MW 25.000) y sulfonato de poliestireno (PSS, MW 70.000) a través de recubrimiento por inmersión utilizando la técnica LbL ^40,41 descrito anteriormente para el sistema utilizado especial en el artículo de Suhr, M. et al. (2014) ^19.
   2. Coloque los sensores dentro de la solución de PE apropiado en profunda wELL placas e incubar estos para 10 min a TA.
   3. Tome los sensores de PE-solución y enjuague los sensores entre cada paso de recubrimiento por inmersión intensiva con agua ultrapura.
      Nota: La nueva modificación de la superficie se compone de al menos tres capas de terminación PE con carga positiva PEI.
   4. Después de esta modificación externa colocar los sensores en el interior del módulo de flujo y equilibrar los sensores de un enjuague con agua ultrapura antes de comenzar los experimentos.
3. SLP1 monocapa recristalización:
   1. Disolver SLP1 en 4 M urea para la conversión de polímeros en monómeros.
   2. Centrifugar las proteínas monomerized a 15.000 xg, 4 ° C durante 1 hora para eliminar aglomerados más grandes de proteínas.
   3. Mezclar el sobrenadante y se centrifugó SLP1 solubilizado con tampón de recristalización a una concentración final de proteína de 0,2 g / L.
      Nota: El calcio recristalización dependiendo de SLP1 (auto-montaje) se inicia mediante la adición del recbúfer rystallization. Por lo tanto, la bomba de la solución mezclada con un caudal de 125 l / min a los sensores (colocado dentro de los módulos de flujo) inmediatamente. La recristalización se realiza después de los valores estables de cambios de frecuencia y de disipación fueron detectados en experimentos QCM-D.
   4. Después de la recristalización con éxito la proteína en la parte superior de los sensores modificado PE-dentro de los módulos de flujo enjuagar los sensores revestidos con tampón de recristalización o ultrapura waterintensively con un caudal de 125 l / min hasta que los valores estables de desplazamientos de frecuencia y la disipación se detectaron.
      Nota: La modificación de la superficie SiO ₂ con PE para los experimentos de sorción posteriores Onto SLP1 monocapa y AFM estudios se visualiza en la Figura 1.

Figura 1. Esquema Diseño de PE modificación de la superficie y SLP1 MonocapaRevestimiento; Esta cifra ha sido modificado desde Suhr, M. et al. (2015) ¹⁹ con permiso de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Metal y metal NP Interacción:
   Nota: La sorción con la solución de sal de metal Au _(HAuCl4 ∙ 3 H ₂ O) se llevó a cabo en concentraciones de 1 mM o 5 mM a pH = 6,0 en 0,9% soluciones de NaCl. Au-NP adsorción se realizó con diluir Au-PN en 1,6 mM de tampón trisódico-citrato a pH ≈ 5,0.
   1. Después del recubrimiento SLP1 éxito en los módulos de flujo, enjuague la capa SLP1 obtenido intensamente con solución de NaCl al 0,9% hasta que se detectaron valores estables de cambios de frecuencia y la disipación.
   2. Bombear la solución preparada de metal (1 mM) y la solución de NP a los módulos de flujo con un caudal de 125 l / min y realizar un seguimiento de la adsorción a la masa Slcapa p1. Masa de adsorción se puede detectar directamente mediante el seguimiento de los cambios de frecuencia se hace referencia a la ecuación de Sauerbrey (ecuación 1).
   3. Después de completar la interacción metal y NP metal, enjuagar la capa con tampón libre de metal / NP para eliminar metales débiles o nanopartículas unidos encuadernados o débiles.
      Nota: Una ilustración de la configuración experimental se muestra en la Figura 2.

Figura 2. Esquema de diseño de la instalación QCM-D usando Flujo Módulo QFM 401 * ^66. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Grabación de Datos y Evaluación:
   1. Registre los cambios en la frecuencia en Hz (Df _n) y la disipación (Dd _n) Dentro de los experimentos QCM-D mediante el uso de QCM-D de software específico.
   2. Uso para la evaluación de la sensibilidad de masa adsorbida (Delta M) la ecuación / modelo Sauerbrey (Ecuación 1) ^{65 66} que es válido para películas delgadas y rígidas acopladas sin fricción a la superficie del sensor aplicado a la ^n-ésimo armónico. El término C (Sauerbrey constante) para el usado 5 MHz en el sensor de cuarzo de corte es de 17,7 ng ∙ ∙ Hz ^-1 cm ^{-2 68.} Para rígida, distribuidas de manera uniforme, y las capas adsorbidas suficientemente delgadas utilizar la ecuación 1 como una buena aproximación.
      
   3. Realizar el modelado adicional de acuerdo al modelo de Kelvin-Voigt válida para moléculas viscoelásticas ^68-71 con el software específico del fabricante y comparar los resultados con los del modelo Sauerbrey.
   4. Para el cálculo del espesor de la capa y el uso de adsorción de masascomo parámetro de modelado importante una densidad de capa de la capa adsorbida de 1,35 g ∙ cm ^-3 correspondiente a los valores descritos anteriormente para las proteínas de la capa S ^72-75. Utilice el mismo valor para el cálculo de la interacción de metal con la capa proteínica.

7. Medidas AFM

1. Realizar estudios con plena capacidad AFM en un microscopio óptico invertido.
   1. Imágenes de AFM Records en líquido utilizando el tampón recristalización o agua ultrapura directamente en los sensores QCM-D recubiertos.
   2. Enjuague los sensores con agua ultrapura después de los experimentos QCM-D y colocarlos dentro de la célula de fluido AFM. Por lo tanto, utilizar una célula de fluido cerrada con un volumen total de aproximadamente 1,5 ml. Mantenga la temperatura de la constante de celda de fluido a 30 ° C.
   3. Utilice un voladizo con una frecuencia de resonancia de 25 kHz ≈ en agua y una rigidez de <0,1 N / m. Ajuste la velocidad de exploración entre 2,5 y 10 micras / seg.
   4. Tomar imágenes en el modo de contacto dinámico mientras que el voladizo es excitado por un piezo a su frecuencia de resonancia. Determine la distancia del voladizo a la superficie por la oscilación de amortiguación ^76.
      Nota: Las imágenes de altura indicadas z escala, mientras que los valores z representan la topografía exacta de la superficie. Amplitud imágenes (Pseudo 3D) se muestran sin z escala porque z valores de amplitud dependen de parámetros de análisis y dan información limitada. Análisis de imágenes se realizó utilizando los tres de software de evaluación diferente ^77.

Resultados

Cultivo de Microorganismos y SLP1 Caracterización

Los datos registrados del crecimiento bacteriano indica el final de la fase de crecimiento exponencial en alrededor de 5 hr. Investigaciones anteriores han demostrado que SLP1 se puede aislar desde este punto de cosecha (4,36 g / L biomasa húmeda (≈ 1,45 g / L (BDW)) con un rendimiento máximo ^19. Sin embargo, la optimización del cultivo mediant...

Discusión

En este trabajo estudiado la unión de Au a las proteínas de la capa S se investigó usando una combinación de diferentes métodos analíticos. En particular, la unión de Au es muy atractivo no sólo para la recuperación de Au de las aguas de minería o las soluciones del proceso, sino también para la construcción de materiales, por ejemplo, superficies sensoriales. Para los estudios de la interacción Au (Au (III) y Au (0) -NPs) con suspensión y monocapa de SLP1 recristalizado, la proteína tuv...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
equiment and software
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System	Applikon Biotechnology, Netherlands	Z6X	Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100	BugLab, Concord (CA), USA	Z9X	---
Spectrometer Ultrospec 1000	Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain	80-2109-10	Company now GE Healthcare Life Sciences
MiniStar micro centrifuge	VWR, Germany	521-2844	For centrifugation of cultivation samples
Research system microscope BX-61	Olympus Germany LLC, Germany	037006	Microscope in combination with imaging software
Cell^P (version 3.1)	Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany	---	together with microscope
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S	Carr Centritech, Florida, USA	9010PLT	For biomasse harvesting
T18 basic Ultra Turrax	IKA Labortechnik, Germany	431-2601	For flagella removal and sample homogenization
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	728411	Used within protein isolation
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot	Microfluidics, Massachusetts, USA	M110EH30K	Used for cell rupture
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer	Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany	102041	---
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c)	Thermo Fisher Scientific, USA	91-ND-2000C-L	For determination of protein concentration
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber	Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany	165-3322	For SDS-PAGE
VersaDoc Imaging System 3000	Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany	1708030	Used for imaging of SDS-PAGE gels
ICP-MS Elan 9000	PerkinElmer, Waltham (MA), USA	N8120536	For determination of metal concentration
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom	ZEN3600	For determination of nanoparticle size
Q-Sense E4 device	Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden	QS-E4	ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform)
Q-Soft 401 (data recording)	Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling)	Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden
QCM-D flow modules QFM 401	Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden	QS-QFM401	ordered via LOT quantum design
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors	Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden	QS-QSX303	ordered via LOT quantum design
Ozone cleaning chamber	Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA	QS-ESA006	ordered via LOT quantum design
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	MFP-3DBio	AFM measurements and imaging software
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	---	imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software	WaveMetrics, Inc., USA	---	imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio
BioHeater	Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA	Bioheater	Sample heater for AFM measurements
Biolever mini cantilever,  BL-AC40TS-C2	Olympus Germany LLC, Germany	BL-AC40TS-C2	Prefered cantilever for AFM measurements
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)	Nanotec Electronica S.L. , Spain	freeware	Software for AFM analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Detergents and other equiment
Calcium chloride Dihydrate (CaCl2 ∙ 2H2O)	Merck KGaA	1.02382	---
acidic acid, 100 %, p.A.	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3738.5	Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Antifoam 204	Sigma-Aldrich Co. LLC.	A6426	For foam suppression
bromophenol blue, sodium salt	Sigma-Aldrich Co. LLC.	B5525	---
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3862.1	---
Deoxyribonuclease II from porcine spleen	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D4138	Typ IV , 2,000-6,000 Kunitz units/mg protein
Ethanol, 95%	VWR, Germany	20827.467	Danger, flammable
glycerine, p.A.	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3783.1	---
Gold(III) chloride trihydrate (HAuCl4 ∙ 3H2O)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	520918	Danger
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	0037.1	---
Hellmanex III	Hellma GmbH & Co. KG	9-307-011-4-507	---
Hydrochloric acid (HCl) (37%)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	4625.2	Danger; Corrosive, used for pH adjustment
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich Co. LLC.	L6876	Lyophilized powder, protein =90 %, =40,000 units/mg protein (Sigma)
Magnesium chloride Hexahydrate (MgCl2 ∙ 6H2O)	Merck KGaA	1.05833	---
Magnetic stirrer with heating,  MR 3000K	Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany	504.10100.00	Standard stirrer within experiment
NB-Media DM180	Mast Diagnostica GmbH	121800	---
Nitric acid (HNO3)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	HN50.1	Danger; Oxidizing, Corrosing
PageRuler Unstained Protein Ladder	ThermoScientific-Pierce	26614	---
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	243051	Average Mw ~70,000
Polyethylenimine (PEI), branched	Sigma-Aldrich Co. LLC.	408727	Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	60108	Warning; Harmful
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R5503	Type I-AS, 50-100 Kunitz units/mg protein
Sodium azide (NaN3)	Merck KGaA	106688	Danger; very toxic and Dangerous for the environment
Sodium chloride (NaCl)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3957.2	---
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	L-5750	Danger; toxic
Sodium hydroxide (NaOH)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	6771.1	Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000	CARL ROTH GmbH+CO.KG	1893.1	---
Sulfuric acid (H2SO4)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	HN52.2	Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation
Tannic acid (C76H52O46)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	16201	---
TRIS HCl (C4H11NO3HCl)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	9090.2	---
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 ∙ 2H2O)	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3580.2	---
Triton X-100	CARL ROTH GmbH+CO.KG	3051.3	Warning; Harmful, Dangerous for the environment
VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Ultrafiltration tubes	Sartorius AG	VS0132	---
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich Co. LLC.	M6250	Danger, toxic