Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

Resumen

Este documento describe un protocolo detallado para usar sondas de tensión basadas en ADN para obtener imágenes de las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunes. Este enfoque puede mapear las fuerzas del receptor >4.7pN en tiempo real y puede integrar fuerzas a lo largo del tiempo.

Resumen

Las fuerzas mecánicas transmitidas en la unión entre dos células vecinas y en la unión entre las células y la matriz extracelular son críticas para regular muchos procesos que van desde el desarrollo hasta la inmunología. Por lo tanto, desarrollar las herramientas para estudiar estas fuerzas a escala molecular es fundamental. Nuestro grupo desarrolló un conjunto de sensores de tensión molecular para cuantificar y visualizar las fuerzas generadas por las células y transmitidas a ligandos específicos. La clase más sensible de sensores de tensión molecular se compone de horquillas de bucle madre-bucle de ácido nucleico. Estos sensores utilizan pares fluoróforo-apagador para informar sobre la extensión mecánica y el despliegue de horquillas de ADN bajo fuerza. Un desafío con los sensores de tensión de horquilla de ADN es que son reversibles con un rápido repliegue de horquilla al finalizar la tensión y, por lo tanto, las fuerzas transitorias son difíciles de registrar. En este artículo, describimos los protocolos para preparar sensores de tensión de ADN que pueden "bloquearse" y evitar que se vuelvan a plegar para permitir el "almacenamiento" de información mecánica. Esto permite el registro de fuerzas piconewton altamente transitorias, que posteriormente pueden ser "borradas" mediante la adición de ácidos nucleicos complementarios que eliminan la cerradura. Esta capacidad de alternar entre el mapeo de tensión en tiempo real y el almacenamiento de información mecánica revela fuerzas débiles, de corta duración y menos abundantes, que son comúnmente empleadas por las células T como parte de sus funciones inmunes.

Introducción

Las células inmunes se defienden contra patógenos y células cancerosas rastreando y escaneando continuamente las superficies de las células diana en busca de antígenos, tachonando su superficie ^1,2. El reconocimiento de antígenos se inicia tras la unión entre el receptor de células T (TCR) y el complejo MHC del complejo de histocompatibilidad péptido-mayor (pMHC) expresado en la superficie de las células diana. Debido a que el reconocimiento TCR-pMHC ocurre en la unión entre dos células móviles, durante mucho tiempo se ha sospechado que experimenta fuerzas mecánicas. Además, esto condujo al modelo mecanosensor de activación TCR, que sugiere que las fuerzas TCR contribuyen a su función ^3,4. Para comprender cuándo, dónde y cómo las fuerzas mecánicas contribuyen a la función de las células T, es imperativo desarrollar herramientas para visualizar las fuerzas moleculares transmitidas por las células T. Tradicionalmente, métodos como la microscopía de fuerza de tracción (TFM) y las matrices de micropilares se utilizan para investigar las fuerzas celulares ^5,6. Sin embargo, la sensibilidad a la fuerza de las matrices TFM y micropilares está en la escala nanonewton (nN) y, por lo tanto, a menudo es insuficiente para estudiar las fuerzas moleculares de piconewton (pN) transmitidas por los receptores celulares⁷. Para mejorar la fuerza y la resolución espacial para la detección, nuestro laboratorio fue pionero en el desarrollo de sondas de tensión molecular, que inicialmente se sintetizaron utilizando polímeros de polietilenglicol (PEG)⁷. Las sondas de tensión molecular están compuestas por un "resorte" molecular extensible (PEG, proteína, ADN) flanqueado por un fluoróforo y un quencher y están anclados en una superficie. Las fuerzas aplicadas al extremo de la sonda conducen a su extensión, separando el fluoróforo y el exprimidor, generando así una fuerte señal de fluorescencia (Figura 1A)^8,9,10.

Durante la última década hemos desarrollado una biblioteca de diferentes clases de sondas de tensión molecular con elementos de resorte hechos de ácidos nucleicos¹¹, proteínas¹⁰ y polímeros⁸. Entre estos, las sondas de tensión basadas en ADN proporcionan la mayor relación señal / ruido y la mayor sensibilidad de fuerza, que se sintoniza fácilmente desde unos pocos pN hasta ~ 20 pN¹¹. Hemos utilizado estas sondas de tensión de ADN en tiempo real para estudiar las fuerzas moleculares generadas por muchos tipos de células diversas, incluidos fibroblastos, células cancerosas, plaquetas y células inmunes^11,12,13. Este manuscrito describirá protocolos para sintetizar y ensamblar sondas de tensión de ADN en una superficie para mapear las fuerzas del receptor molecular con resolución de fuerza pN utilizando un microscopio de fluorescencia convencional. Si bien el procedimiento actual incluye modificaciones químicas al ácido nucleico para introducir el reportero fluorescente (Figura 1B), es importante tener en cuenta que muchos de los pasos de modificación y purificación pueden subcontratarse a compañías personalizadas de síntesis de ADN. Por lo tanto, la tecnología de sondas de tensión de ADN es fácil y accesible para las comunidades más amplias de biología celular y mecanobiología.

Brevemente, para ensamblar sensores de tensión de ADN, una horquilla de ADN se hibrida con una hebra de ligando fluorescente en un brazo y una hebra de anclaje de quencher en el otro brazo y luego se inmoviliza en un sustrato de vidrio (Figura 1C, tensión en tiempo real). En ausencia de fuerza mecánica, la horquilla se cierra y, por lo tanto, la fluorescencia se apaga. Sin embargo, cuando la fuerza mecánica aplicada es mayor que F_1/2 (la fuerza en equilibrio que conduce a una probabilidad del 50% de despliegue), la horquilla se derrite mecánicamente y se genera una señal fluorescente.

Sobre la base del sensor de tensión de ADN en tiempo real, también describimos protocolos para mapear las fuerzas acumuladas, lo que es particularmente útil para estudiar las interacciones entre los receptores en las células inmunes y su ligando natural. Esto se debe a que los receptores inmunes a menudo muestran enlaces de corta duración ^3,14. Las fuerzas acumuladas se visualizan utilizando una hebra de "bloqueo" que se une preferentemente a horquillas de ADN abiertas y permite el almacenamiento de señales de fluorescencia asociadas con eventos de tracción mecánica (Figura 1C, tensión bloqueada). La hebra de bloqueo está diseñada para unir un sitio de unión críptico que se expone al derretir mecánicamente la horquilla inducida mecánicamente y bloquear la horquilla en estado abierto bloqueando el plegado de la horquilla, almacenando así la señal de tensión y generando un mapa de tensión acumulada. Además, la hebra de bloqueo está diseñada con un punto de apoyo de ocho nucleótidos, que permite una reacción de desplazamiento de la hebra mediada por la puntera con su complemento completo, la hebra de "desbloqueo". Con la adición de la hebra de desbloqueo, la hebra de bloqueo atada se quita de la construcción de horquilla, borrando la señal de tensión almacenada y restableciendo la horquilla al estado en tiempo real.

Figura 1: Esquema de las sondas de tensión molecular de última generación. (A) Diseño general de sondas de tensión molecular en tiempo real, (B) hebras para la construcción de la sonda de tensión basada en ADN, y (C) sondas de tensión basadas en ADN diseñadas y su alternancia entre el estado en tiempo real y el estado bloqueado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El protocolo principal consta de cuatro secciones principales: preparación de oligonucleótidos, preparación de superficies, imágenes y análisis de datos. Este protocolo ha sido demostrado con éxito por nuestro laboratorio y otros en células T OT-1 CD8 + ingenuas y activadas, células OT-II CD4 ⁺, así como hibridomas, y se puede aplicar para interrogar diferentes receptores de células inmunes, incluidos el receptor de células T, el receptor de muerte celular programada (PD1) y las fuerzas del antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1). Las células T OT-1 CD8 ⁺ no naïve se utilizan como una línea celular de ejemplo en este documento.

Protocolo

Los ratones transgénicos OT-1 se encuentran en la División de Recursos Animales de la Universidad de Emory. Todos los experimentos fueron aprobados y realizados bajo el protocolo del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

1. Preparación de oligonucleótidos

1. Disuelva el ADN de la hebra de ligando en agua (resistividad de 18,2 MΩ, utilizada en todo el protocolo). Vortex y gire hacia abajo la solución con una centrífuga de mesa. Ajuste el volumen de agua de tal manera que la concentración final sea de 1 mM. Validar la concentración mediante el uso de un espectrofotómetro de nanogotas para medir la absorbancia a 260 nm y determinar la concentración final en función del coeficiente de extinción del oligonucleótido.
   NOTA: La hebra del ligando tiene una modificación en cada extremo, 5' amina y 3' biotina, para conjugarse con el fluoróforo y presentar el ligando biotinilado. El grupo amina en la hebra del ligando debe conjugarse con un fluoróforo. El colorante Cy3B se utiliza para esta conjugación debido a su alto brillo y fotoestabilidad, pero generalmente no se ofrece comercialmente y requiere conjugación interna. En consecuencia, la siguiente sección describe la conjugación entre aminas y colorantes éster NHS. Para los usuarios finales que no tienen acceso a instalaciones o recursos para la modificación de ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos modificados se pueden comprar a proveedores de síntesis de ADN personalizados que ofrecen tintes brillantes y fotoestables, como la familia de tintes Alexa y Atto.
2. Prepare soluciones 10x PBS y 1 M NaHCO₃ . Mezclar 10 μL de la solución de ligando de amina de 1 mM (10 nmol) con 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO₃ y 60 μL de_H2O. Disolver 50 μg de éster Cy3B NHS en 10 μL de DMSO inmediatamente antes de usar y añadir a la mezcla para obtener un volumen de reacción total de 100 μL. Añadir Cy3B NHS éster al final. Dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h o 4 °C durante la noche.
3. Prepare la hebra de bloqueo Atto647N conjugando la hebra de bloqueo de amina con el éster Atto647N NHS. Prepare 10x PBS y 1 M NaHCO₃ solución. Mezclar 10 μL de la solución de cadena bloqueante de amina de 1 mM (10 nmol) con 10 μL de 10x PBS, 10 μL de 1 M NaHCO₃ y 60 μL de_H2O. Disolver 50 μg de éster Atto647N NHS en 10 μL de DMSO inmediatamente antes de su uso y añadir a la mezcla para obtener un volumen de reacción total de 100 μL. Añadir Atto647N NHS éster al final. Dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 1 h o 4 °C durante la noche.
4. Después de las reacciones, elimine los subproductos, el exceso de colorante y las sales mediante filtración de gel desalinizante P2. Diluir la mezcla de reacción con_H2Ohasta un volumen total de 300 μL, que sea apropiado para la siguiente etapa de purificación por HPLC. Agregue 650 μL de gel P2 hidratado a un dispositivo centrífugo y gire hacia abajo a 18,000 x g durante 1 minuto. Retire el líquido en la parte inferior del dispositivo, agregue la mezcla de reacción a la columna que contiene gel P2, gire hacia abajo a 18,000 x g durante 1 minuto y recoja la mezcla de reacción en la parte inferior del dispositivo.
   NOTA: P2 gel debe hidratarse al menos 4 h antes de usar con_H2O.
5. Purificar la mezcla de reacción desalinizada con HPLC utilizando una columna C18 designada para la purificación de oligonucleótidos, con disolvente A: 0,1 M TEAA en_H2Oy B:ACN como fase móvil para una elución de gradiente lineal 10-100% B durante 50 min a un caudal de 0,5 mL/min. Inyectar la mezcla de reacción desalinizada en HPLC de fase inversa con un bucle de inyección de 500 μL para su purificación. Recoja el producto que tiene un pico de absorbancia para el ADN (260 nm) y un pico de absorbancia para el fluoróforo (560 nm para Cy3B y 647 nm para Atto647N) y séquelos en un concentrador centrífugo de vacío durante la noche (véase la figura 2A).
6. Reconstituir el producto oligocolorante seco en 100 μL de agua. Determine la concentración de la hebra de ligando Cy3B y la hebra de bloqueo Atto647N con el espectrofotómetro de nanogota. Asegúrese de que la proporción de etiquetado del tinte sea cercana a 1: 1. Corrija la absorbancia de 260 nm del colorante si es necesario al determinar la concentración de oligonucleótidos.
7. Validar el producto purificado con MALDI-TOF-MS utilizando 3-HPA como sustrato en 50% ACN/_H2Ocon 0,1% TFA y 5 mg/ml de citrato de amonio utilizando 0,5 μL del producto a 1-5 μM para la preparación de muestras MALDI-TOF-MS. Un ejemplo de espectro de masas se puede encontrar en la Figura 2B.
8. Disuelva la horquilla y la hebra de anclaje en agua y asegúrese de que la concentración de las soluciones madre esté entre 50 y 100 μM.
   NOTA: La horquilla no está modificada y se puede sintetizar directamente de forma personalizada de un proveedor. La hebra de anclaje tiene un grupo de anclaje de tiol y un quencher BHQ2 y se puede sintetizar directamente de forma personalizada de un proveedor.
9. Alícuota todos los oligonucleótidos. Para uso y almacenamiento a corto plazo, almacenar estos oligonucleótidos a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, congelarlos y mantenerlos a -20 °C. En este punto, todos los oligonucleótidos están listos para el ensamblaje de la sonda de tensión de ADN.
   NOTA: Los ciclos repetidos de congelación-descongelación no son problemáticos para los oligonucleótidos.

2. Preparación de la superficie

NOTA: La preparación de sustratos de sonda de tensión de horquilla de ADN lleva dos días. La sonda de tensión de horquilla de ADN se funcionalizará en cubreobjetos de vidrio.

1. Día 1
   1. Coloque los cubreobjetos de 25 mm en una rejilla de politetrafluoroetileno en un vaso de precipitados de 50 ml. Cada bastidor puede contener hasta 8 cubreobjetos. Enjuague los cubreobjetos sumergiéndolos en agua tres veces.
   2. Agregue 40 ml de una solución de etanol mezclado con agua al vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos, y selle el vaso de precipitados con una película de parafina.
   3. Sonicar el vaso de precipitados durante 15 minutos en un limpiador de ultrasonidos (frecuencia de funcionamiento de 35 KHz) para limpiar los cubreobjetos. Después de la sonicación, deseche el líquido y enjuague el vaso de precipitados con la rejilla y cubra con agua al menos 6 veces para eliminar cualquier solvente orgánico restante.
   4. Prepare una solución fresca de piraña mezclando ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno en una proporción de 3: 1. Para hacer 40 ml de solución de piraña , agregue 30 ml de ácido sulfúrico a un vaso de precipitados limpio de 50 ml primero y luego agregue lentamente 10 ml de_H2O2. La solución de piraña se calentará rápidamente y burbujeará al agregar el_H2O2. Mezclar suavemente la piraña con el extremo de una pipeta de vidrio.
   5. A continuación, transfiera la rejilla que sujeta los cubreobjetos al vaso de precipitados que contiene una solución de piraña suavemente mezclada para grabado (Figura 3A). Deje que la solución de piraña hidroxile y limpie los cubreobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del grabado de piraña, transfiera la rejilla con pinzas de acero o politetrafluoroetileno a un vaso de precipitados limpio de 50 ml con agua y enjuague nuevamente con agua al menos 6 veces.
      PRECAUCIÓN: Grandes cantidades de sustancias orgánicas podrían reaccionar vigorosamente con la solución de piraña y pueden causar una explosión. Tenga cuidado y siempre trabaje con la solución Piranha en una campana extractora. Asegúrese de usar una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad. Nunca guarde la solución fresca de piraña en un recipiente sellado.
      NOTA: La proporción de peróxido de hidrógeno a ácido sulfúrico debe mantenerse por debajo de 1: 2 (v: v) y nunca debe exceder 1: 1. Al sumergir la rejilla con cubreobjetos en solución Piranha, colóquelos en la solución lenta y cuidadosamente. No deseche la solución inmediatamente después del grabado, ya que todavía está activa y caliente. Déjelo en el vaso de precipitados durante la noche antes de verterlo en el recipiente de desechos ácidos.
   6. Sumerja la rejilla que sostiene los cubreobjetos en un vaso de precipitados de 50 ml con 40 ml de etanol para eliminar el agua. Deseche el etanol y repita 3 veces para asegurarse de que el agua haya sido eliminada.
   7. Luego sumerja la rejilla en aminopropil trietoxisilano al 3% (APTES) (v / v) en 40 ml de etanol para reaccionar con el -OH en los cubreobjetos durante 1 h a temperatura ambiente (Figura 3B).
      NOTA: El etanol puede ser reemplazado por acetona.
   8. Enjuague las superficies 6 veces sumergiéndolas en 40 ml de etanol, luego séquelas en el horno a 80 °C durante 20 minutos. Después del enfriamiento, guarde los cubreobjetos modificados con aminas secas a -20 °C para su uso futuro (hasta 6 meses).
   9. Cubra la parte inferior interna de las placas de Petri de plástico de 10 cm de diámetro con película de parafina. La película de parafina evita que los cubreobjetos se deslicen dentro de la placa de Petri y ayuda a mantener la solución para los próximos pasos de funcionalización en los cubreobjetos. Coloque los cubreobjetos modificados con aminas enfriadas en las placas de Petri. El lado a funcionalizar debe estar mirando hacia arriba.
   10. Para modificar los grupos amina en los cubreobjetos, añadir 300 μL de 0,5% p/v de ácido lipoico PEG NHS (LA-PEG-SC) y 2,5% p/v mPEG NHS (mPEG-SC) en 0,1 M NaHCO₃ en cada cubreobjetos e incubar durante 1 h a temperatura ambiente (Figura 3C). Por cada cubreobjetos de 25 mm, pesar 1,5 mg de LA-PEG-SC y 7,5 mg de mPEG-SC. Disuelva los reactivos NHS inmediatamente antes de agregarlos a las superficies, ya que tienen una vida media corta (~ 10 min) en solución acuosa a temperatura ambiente. Después de la reacción, enjuague las superficies 3 veces con agua.
       NOTA: La reacción del NHS se puede realizar a 4 °C durante la noche. Los reactivos del NHS tienen una vida media más larga antes de la hidrólisis a 4 °C, que es alrededor de 4-6 h. Esto dará como resultado un procedimiento de preparación de superficie de tres días.
   11. Añadir 100 μL de NaHCO₃ 0,1 M que contenga 1 mg/ml de acetato de sulfo-NHS a un conjunto de cubreobjetos "sándwich" (dos cubreobjetos uno frente al otro con tampón de reacción en el medio). Permita que la pasivación ocurra durante al menos 30 minutos. Para ahorrar reactivo, este paso podría realizarse con 50 μL de acetato de sulfo-NHS de 1 mg/ml. Enjuague con agua tres veces después de la pasivación.
   12. Agregue 0.5 ml de nanopartículas de oro (AuNP, 8.8 nm, ácido tánico, 0.05 mg / ml) a cada cubreobjetos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (Figura 3D). Para guardar el reactivo, este paso se puede hacer intercalando dos cubreobjetos también. Asegúrese de que no haya sales presentes en el sistema de los pasos anteriores para evitar la agregación de nanopartículas de oro. No deje que los cubreobjetos se sequen después de este paso.
   13. Mientras tanto, la horquilla prehibridada de 4.7 pN, la hebra de ligando Cy3B y la hebra de anclaje BHQ2 que forman las sondas de tensión de ADN se construyen en una proporción de 1.1: 1: 1 en 1 M NaCl a 300 nM en un tubo de PCR. Analice las hebras calentando la solución hasta 95 °C durante 5 min, luego enfríe gradualmente disminuyendo la temperatura a 20 °C durante 30 min en un termociclador.
   14. Enjuague los cubreobjetos con agua tres veces después de 30 minutos de incubación con nanopartículas de oro. Agregue una hebra de anclaje BHQ2 adicional (de 100 μM) a la solución de ADN recocido para hacer la relación entre la hebra de anclaje BHQ2 y la hebra de ligando Cy3B 10: 1. En este punto, la solución de ADN debe contener 300 nM de construcción de sonda de tensión y 2,7 μM de hebra BHQ2. Agregue 100 μL por dos cubreobjetos para hacer el "sándwich" (Figura 3E).
   15. Coloque cuidadosamente una bola de tejido de laboratorio húmeda en la placa de Petri (lejos de cubreobjetos) y selle el plato con una película de parafina para evitar que la solución se seque. Cubrir el plato con papel de aluminio e incubar a 4 °C durante la noche.
2. Día 2
   1. Lave el exceso de sondas de los cubreobjetos con 1x PBS. Verifique la calidad de la superficie de la sonda de tensión de ADN bajo un microscopio epifluorescente.
   2. Preparar 40 μg/ml de estreptavidina en 1x PBS e incubar en cubreobjetos durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 3F). Por lo general, 100 μL es suficiente para un cubreobjetos de 25 mm. Enjuague con PBS 3 veces después de la incubación para eliminar la cantidad excesiva de estreptavidina.
   3. Preparar 40 μg/ml de anticuerpo/ligando biotinilado en 1x PBS. Añadir 50-100 μL por sándwich e incubar durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 3G). Enjuague con PBS tres veces después de la incubación para eliminar la cantidad excesiva de anticuerpo/ligando biotinilado.
   4. Ensamble cuidadosamente las cámaras de imágenes limpias con superficies. Las superficies se pueden agrietar fácilmente al apretar las cámaras. Agregue 0.5-1 ml de solución salina balanceada de Hank (HBSS) a las cámaras de imágenes y manténgalas listas para obtener imágenes con células (Figura 3H).

3. Obtención de imágenes de las fuerzas del receptor celular

1. Preparar las células inmunes de interés en HBSS a 1-2 x 10⁶ células/ml.
   NOTA: Las células OT-1 CD8+ naïve se utilizan como ejemplo en este documento. Purificar las células T no infectadas con CD8+ OT-1 del bazo de ratones sacrificados utilizando el kit de aislamiento de células T CD8⁺ de ratón MACS con un separador MACS siguiendo las instrucciones del fabricante. Aísle y enriquezca las células T CD8 + eliminando cualquier célula T no CD8 ⁺ a la que se unieron los anticuerpos que agotan magnéticamente. Resuspenda las células T purificadas OT-1 CD8 + no tratadas con tratamiento previo en HBSS a 2 x 10⁶ células/ml y manténgalas en hielo antes de usarlas.
2. Verifique la calidad de la superficie de la sonda de tensión de horquilla de ADN bajo un microscopio de fluorescencia (objetivo 100x) para el control de calidad antes de agregar ligandos o células de recubrimiento. Obtener una imagen y cuantificar la intensidad de fondo promedio en el canal Cy3B de una superficie de sonda de tensión de horquilla de ADN desde al menos 5 posiciones diferentes y 3 réplicas. Mantenga las condiciones de adquisición de imágenes consistentes para que este valor pueda usarse como un marcador confiable de la calidad de la superficie y la densidad de la sonda (Figura 4C).
   NOTA: Cuantificar el número de hebras de ADN por nanopartícula de oro y el número de nanopartículas de oro por μm2 las primeras veces de preparación de la superficie de acuerdo con la literatura¹², que puede usarse como otro marcador confiable de la calidad de la superficie.
3. Placa ~4 x 10 4 - 10 x 10⁴ celdas en cada cubreobjetos funcionalizados de la sonda de tensión de ADN y permite que se unan y se extiendan durante ~15 min a temperatura ambiente.
4. A medida que las células se colocan en las sondas de tensión de horquilla de ADN y comienzan a propagarse, obtenga una imagen de las señales de fluorescencia que se generan en el canal Cy3B con el objetivo 100x (Figura 3I).
5. Después de que las células comiencen a producir una señal de tensión en tiempo real en la superficie de la sonda de tensión de horquilla de ADN en el canal Cy3B, adquiera imágenes en los canales Cy3B y Atto647N (la microscopía TIRF proporciona una mejor relación señal-ruido que la epifluorescencia). Posteriormente, agregue la hebra Atto647N a las cámaras de imagen a una concentración final de 200 nM para la hibridación mecánicamente selectiva.
6. Después de 10 minutos de incubación, retire rápida y suavemente el tampón que contiene la hebra de bloqueo fluorescente Atto647N y reemplácela con sales frescas balanceadas de Hank. Imagen en los canales Cy3B y Atto647N de nuevo y determinar el coeficiente de correlación de Pearson con el software Fiji¹⁵.
7. En el momento de interés para la investigación, introducir una hebra de bloqueo no fluorescente a las células en la cámara de imágenes para almacenar la señal de tensión. Preparar el material de bloqueo de la hebra (100 μM) y añadir a las células a una concentración final de 1 μM. Pipetear suavemente para mezclar. La duración del bloqueo puede variar, pero 10 minutos es el tiempo recomendado.
8. Adquiera películas de lapso de tiempo o imágenes de punto final en epifluorescencia tanto para mapeo de tensión cualitativo como para análisis cuantitativo según sea necesario (Figura 3J y Figura 5).
   NOTA: Si se desea medir la tensión en varios puntos de tiempo, inicie el borrado de las señales de tensión almacenadas mediante la adición de una hebra de desbloqueo. Para evitar el enjuague excesivo, se utiliza una mayor concentración final de hebra de desbloqueo a 2 μM para iniciar una reacción de desplazamiento de la hebra mediada por la puntera con la hebra de bloqueo durante 3 minutos, lo que borra las señales almacenadas (Figura 3J). Enjuague suavemente el exceso de oligonucleótidos con HBSS. La superficie de la sonda de tensión de horquilla de ADN y las células están listas para otra ronda de almacenamiento y mapeo de tensión. El desbloqueo de las señales de tensión no es necesario si solo un punto de tiempo es de interés en el estudio.

4. Análisis de datos

NOTA: El análisis de imágenes se realiza utilizando el software Fiji, y el análisis cuantitativo se realiza utilizando el software de análisis.

1. Corrija cualquier desviación durante la adquisición de imágenes con el comando Corregir desviación 3D en Registro en el menú Plugins .
2. Elimine el fondo de la cámara de la imagen con el comando Restar en el menú Proceso .
3. Determine el coeficiente de correlación de Pearson con la función Colocalización en el menú Analizar .
4. Promediar y restar el fondo de fluorescencia producido por las sondas no abiertas de tres regiones de fondo locales diferentes. Dibuje ROI de celdas en imágenes sustraídas al fondo o imágenes RICM (microscopía de contraste de interferencia de reflexión) con la herramienta Image J Freehand Selections . Mida cualquier métrica de interés de los ROI, por ejemplo, la intensidad de fluorescencia integrada y la ocupación de la tensión utilizando la herramienta Medir en el menú Analizar (Figura 6).
5. Exporte las mediciones para el análisis cuantitativo con el software de análisis.
6. Trazar los datos con cualquier software de análisis.

Resultados

Aquí mostramos imágenes representativas del control de calidad de la superficie (Figura 4). Una superficie de alta calidad debe tener un fondo limpio en el canal RICM (Figura 4B) y una intensidad de fluorescencia uniforme en el canal Cy3B (Figura 4C). Con el mismo equipo de imágenes y condiciones idénticas de adquisición de imágenes de fluorescencia, la intensidad de fluorescencia de fondo debe ser consistente y reproducible c...

Discusión

Con los procedimientos detallados proporcionados aquí, se pueden preparar sustratos de sonda de tensión de horquilla de ADN para mapear y cuantificar la tensión del receptor producida por las células inmunes. Cuando las células se colocan en el sustrato de la sonda de tensión de horquilla de ADN, aterrizan, se unen y se propagan a medida que los receptores detectan los ligandos tanto química como mecánicamente, el último de los cuales es detectado por nuestras sondas. Sin embargo, en algunos casos las células p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal