免疫細胞による一過性ピコニュートン受容体力をマッピングするためのDNA張力プローブ

要約

この論文では、DNAベースのテンションプローブを使用して免疫細胞によって加えられる受容体力を画像化するための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、受容体の力>4.7pNをリアルタイムでマッピングし、時間の経過とともに力を積分することができます。

要約

隣接する2つの細胞間の接合部および細胞と細胞外マトリックス間の接合部で伝達される機械的な力は、発生から免疫学に至るまでの多くのプロセスを調節するために重要です。したがって、分子スケールでこれらの力を研究するためのツールを開発することが重要です。私たちのグループは、細胞によって生成され、特定のリガンドに伝達される力を定量化および視覚化するための一連の分子張力センサーを開発しました。最も感度の高いクラスの分子張力センサーは、核酸ステムループヘアピンで構成されています。これらのセンサーは、蛍光色素と消光物質のペアを使用して、力によるDNAヘアピンの機械的伸長と展開について報告します。DNAヘアピン張力センサーの課題の1つは、張力の終了時にヘアピンが急速に折りたたまれて可逆的であるため、過渡力を記録するのが難しいことです。本稿では、機械的情報の「保存」を可能にするために「ロック」して折り畳みを防止できるDNA張力センサーを準備するためのプロトコルについて説明します。これにより、非常に過渡的なピコネウトン力の記録が可能になり、ロックを除去する相補的核酸を添加することで、その後「消去」することができます。リアルタイムの張力マッピングと機械的情報保存を切り替えるこの能力は、T細胞が免疫機能の一部として一般的に使用する、弱く、短命で、存在量の少ない力を明らかにします。

概要

免疫細胞は、標的細胞の表面を連続的に這い回って抗原を探し、その表面をスタッディングすることにより、病原体や癌細胞から防御します^1,2。抗原認識は、T細胞受容体(TCR)と標的細胞の表面に発現するペプチド主要組織適合遺伝子複合体MHC(pMHC)複合体との間の結合時に開始される。TCR-pMHC認識は2つのモバイルセル間の接合部で発生するため、機械的な力を受けることが長い間疑われてきました。さらに、これはTCR活性化のメカノセンサーモデルにつながり、TCR力がその機能に寄与することを示唆しています^3,4。機械的な力がいつ、どこで、どのようにT細胞の機能に寄与するかを理解するには、T細胞によって伝達される分子力を視覚化するツールを開発することが不可欠です。伝統的に、牽引力顕微鏡(TFM)やマイクロピラーアレイなどの方法が細胞力を調べるために使用されます^5,6。しかし、TFMおよびマイクロピラーアレイの力感度はナノニュートン(nN)スケールであるため、細胞受容体によって伝達される分子ピコニュートン(pN)力を研究するには不十分なことがよくあります⁷

プロトコル

OT-1トランスジェニックマウスは、エモリー大学の動物資源施設に収容されています。すべての実験は、施設動物管理および使用委員会(IACUC)プロトコルの下で承認および実施されました。

1. オリゴヌクレオチド調製

1. リガンド鎖DNAを水に溶解します(18.2 MΩの抵抗率、プロトコル全体で使用)。卓上遠心分離機で溶液を渦巻き、スピンダウンします。最終濃度が1 mMになるように水の量を調整します。ナノドロップ分光光度計を使用して濃度を検証し、260 nmでの吸光度を測定し、オリゴヌクレオチドの吸光係数に基づいて最終濃度を決定します。
   注:リガンド鎖は、フルオロフォアと結合し、ビオチン化リガンドを提示するために、各末端、5'アミンおよび3'ビオチンに修飾されています。配位子鎖のアミン基は、蛍光色素と結合する必要があります。Cy3B色素は、その高い輝度と光安定性のためにこの結合に使用されますが、一般的には市販されておらず、社内の抱合が必要です。したがって、次のセクションでは、アミンとNHSエステル染料との間の結合について説明する。核酸修飾のための施設やリソースにアクセスできないエンドユーザーのために、修飾核酸は、AlexaやAttoファミリーの色素など、明るく光安定性のある色素を提供するカスタムDNA合成ベンダーから購入できます。
2. 10x PBSおよび1 M NaHCO₃ 溶液を調製します。10 μLの1 mMアミン....

結果

代表的な表面品質管理画像を示します(図4)。高品質の表面は、RICMチャネルでクリーンなバックグラウンドを持ち(図4B)、Cy3Bチャネルで均一な蛍光強度を持つ必要があります(図4C)。同じイメージング機器と同一の蛍光イメージング取得条件では、DNAプローブで実験を行う場合、バックグラウンド蛍光強度は毎回一貫して再現性.......

ディスカッション

ここで提供される詳細な手順を使用して、免疫細胞によって産生される受容体張力をマッピングおよび定量するためのDNAヘアピン張力プローブ基板を調製することができます。細胞がDNAヘアピンテンションプローブ基板にプレーティングされると、受容体が化学的および機械的にリガンドを感知し、後者はプローブによって検出されるため、細胞は着地、付着、拡散します。ただし、場合に?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal