Observación del fotoconducto en Chlamydomonas reinhardtii

Resumen

La mayoría de los organismos fotoautótrofos que nadan muestran cambios de comportamiento fotoinducidos (fotocomportamiento). El presente protocolo observa dicho fotocomportamiento en el organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii.

Resumen

Para la supervivencia de los microorganismos fotótrofos móviles, es crucial estar en condiciones de luz adecuadas. En consecuencia, muestran comportamientos fotoinducidos (o fotoconducto) y alteran su dirección de movimiento en respuesta a la luz. Los fotoconductos típicos incluyen respuesta de fotochoque (o fotofóbico) y fototaxis. El fotoshock es una respuesta a un cambio repentino en la intensidad de la luz (por ejemplo, iluminación del flash), en el que los organismos dejan de moverse transitoriamente o retroceden. Durante la fototaxis, los organismos se mueven hacia la fuente de luz o en la dirección opuesta (llamada fototaxis positiva o negativa, respectivamente). El alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii es un organismo excelente para estudiar el fotoconducto porque cambia rápidamente su patrón de natación modulando el latido de los cilios (también conocidos como flagelos) después de la fotorrecepción. Aquí, se muestran varios métodos simples para observar fotocomportadores en C. reinhardtii. La investigación sobre los fotoconductos de C. reinhardtii ha llevado al descubrimiento de mecanismos reguladores comunes entre los cilios eucariotas y las canalrodopsinas, que pueden contribuir a una mejor comprensión de las ciliopatías y al desarrollo de nuevos métodos optogenéticos.

Introducción

La luz es una fuente de energía indispensable para los organismos fotosintéticos, pero demasiada luz puede causar daño foto-oxidativo. Por lo tanto, los organismos fototróficos necesitan sobrevivir bajo luz de intensidad moderada, donde pueden fotosintetizar pero no sufrir daño foto-oxidativo¹. En las plantas terrestres, los cloroplastos no pueden salir de la hoja y mostrar movimientos fotográficos en la célula; Los cloroplastos se desplazan a la periferia de la célula bajo alta luz y a la superficie celular bajo poca luz², mientras que muchas algas móviles muestran fotoconductos que les permiten encontrar condiciones de....

Protocolo

En el presente estudio, se utilizó una cepa de tipo salvaje de Chlamydomonas reinhardtii, una progenie del cruce CC-124 x CC-125 con agg1+mt-,²¹. CC-124 y CC-125 se obtuvieron del Centro de Recursos de Chlamydomonas (ver Tabla de Materiales) y se mantuvieron en un medio de tris-acetato-fosfato (TAP)²², 1,5% de agarosa a 20-25 °C. Cualquier cepa móvil se puede utilizar para este protocolo.

1. Cultivo celular

1. Cultive una cepa de interés de Chlamydomonas reinhardtii en medio líquido TAP con aireación burbujeando aire estéril en un per....

Resultados

Aquí se muestran los ensayos típicos de respuesta de fototaxis y fotochoque de C. reinhardtii . Después de la estimación de la densidad celular, el cultivo celular de tipo salvaje (una progenie de la cruz CC-124 × CC-125 con agg1+ mt -)²³ se lavó con una solución experimental de fotoconducto para el ensayo de plato de fototaxis. La suspensión celular se colocó bajo una luz roja tenue durante ~ 1 h. Se colocó una suspensión celular de 2 ml en una placa de Petri de 3,5 cm. La pla.......

Discusión

El protocolo actual es fácil y no requiere mucho tiempo. Si se sospecha que un mutante de C. reinhardtii presenta defectos en la fotorrecepción o el movimiento ciliar, este método podría servir como análisis fenotípico primario.

Sin embargo, existen algunos pasos críticos. Una es usar células en el experimento en la fase de crecimiento temprano a medio log. Después del cultivo durante largos períodos, las células se vuelven menos móviles, menos sensibles a la luz e incluso.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tube	SARSTEDT	62.554.502
5 mm Cannonball green LED	Optosupply	OSPG5161P
50 mL conical tube	SARSTEDT	62.547.254
AC adaptor for the light box	ATTO	2196161
Auto cell counter	DeNovix	CellDrop BF
CaCl2	Nakalai tesque	06731-05
Camera flash	NEWWER	TT560
Centrifuge	KUBOTA	2800
Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125	Chlamydomonas Resource Center		https://www.chlamycollection.org/
C-mout CCD camera	Wraymer	1129HMN1/3
Desktop darkroom	Scientex	B-S8
Digital still camera	SONY	RX100II
EGTA	Dojindo	G002
Fiji			https://fiji.sc/
Green LED plate	CCS	ISLM-150X150-GG
HCl	Fujifilm WAKO	080-01066
HEPES	Dojindo	GB70
KCl	Nakalai tesque	238514-75
Lightbox (Flat viewer)	ATTO	2196160
Microscope	Olympus	BX-53
Petri dish (φ3.5 cm)	IWAKI	1000-035
Pottasium acetate	Nakalai tesque	28434-25
Power supply for the green LED plate	CCS	ISC-201-2
Red filter	Shibuya Optical	S-RG630