Osservazione del comportamento fotografico in Chlamydomonas reinhardtii

Riepilogo

La maggior parte degli organismi fotoautotrofici che nuotano mostrano cambiamenti comportamentali fotoindotti (comportamento fotografico). Il presente protocollo osserva il suddetto comportamento fotografico nell'organismo modello Chlamydomonas reinhardtii.

Abstract

Per la sopravvivenza dei microrganismi fototrofici mobili, essere in condizioni di luce adeguate è fondamentale. Di conseguenza, mostrano comportamenti fotoindotti (o fotocomportamenti) e alterano la loro direzione di movimento in risposta alla luce. I comportamenti fotografici tipici includono la risposta al fotoshock (o fotofobico) e la fototassi. Il photoshock è una risposta a un improvviso cambiamento dell'intensità della luce (ad esempio, l'illuminazione del flash), in cui gli organismi smettono temporaneamente di muoversi o si muovono all'indietro. Durante la fototaxi, gli organismi si muovono verso la sorgente luminosa o nella direzione opposta (chiamata fototassi positiva o negativa, rispettivamente). L'alga verde unicellulare Chlamydomonas reinhardtii è un organismo eccellente per studiare il comportamento fotografico perché cambia rapidamente il suo modello di nuoto modulando il battito delle ciglia (alias flagelli) dopo la fotoricezione. Qui, vengono mostrati vari metodi semplici per osservare i comportamenti fotografici in C. reinhardtii. La ricerca sui fotocomportamenti di C. reinhardtii ha portato alla scoperta di meccanismi regolatori comuni tra ciglia eucariotiche e channelrhodopsins, che possono contribuire a una migliore comprensione delle ciliopatie e allo sviluppo di nuovi metodi optogenetici.

Introduzione

La luce è una fonte di energia indispensabile per gli organismi fotosintetici, ma troppa luce può causare danni fotoossidanti. Pertanto, gli organismi fototrofici devono sopravvivere sotto una luce di intensità moderata, dove possono fotosintetizzare ma non subire danni foto-ossidativi¹. Nelle piante terrestri, i cloroplasti non possono uscire dalla foglia e mostrare movimenti fotografici nella cellula; i cloroplasti si spostano alla periferia della cellula in condizioni di luce intensa e la superficie cellulare in condizioni di scarsa illuminazione², mentre molte alghe mobili mostrano fotocomportamenti che consentono lo....

Protocollo

Nel presente studio, un ceppo wild-type di Chlamydomonas reinhardtii, una progenie della croce CC-124 x CC-125 con agg1+mt-, è stato utilizzato²¹. CC-124 e CC-125 sono stati ottenuti dal Chlamydomonas Resource Center (vedi Tabella dei materiali) e mantenuti su un mezzo tris-acetato-fosfato (TAP)²², 1,5% di agarosio a 20-25 °C. Qualsiasi ceppo mobile può essere utilizzato per questo protocollo.

1. Coltura cellulare

1. Coltivare un ceppo di interesse di Chlamydomonas reinhardtii in mezzo liquido TAP con aerazione facendo gorgogliare ari....

Risultati

I tipici saggi di fototassi e risposta al fotoshock di C. reinhardtii sono mostrati qui. Dopo la stima della densità cellulare, la coltura cellulare wild-type (una progenie della croce CC-124 × CC-125 con agg1+ mt -)²³ è stata lavata con una soluzione sperimentale di fotocomportamentare per il test della piastra di fototaxi. La sospensione cellulare è stata posta sotto una debole luce rossa per ~ 1 ora. Una sospensione cellulare da 2 ml è stata collocata in una capsula di Petri da 3,.......

Discussione

Il presente protocollo è facile e non richiede molto tempo. Se si sospetta che un mutante di C. reinhardtii presenti difetti nella fotoricezione o nel moto ciliare, questo metodo potrebbe servire come analisi fenotipica primaria.

Tuttavia, esistono alcuni passaggi critici. Uno è quello di utilizzare le cellule nell'esperimento nella fase di crescita da iniziale a metà registro. Dopo aver coltivato per lunghi periodi, le cellule diventano meno mobili, meno sensibili alla luce e form.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tube	SARSTEDT	62.554.502
5 mm Cannonball green LED	Optosupply	OSPG5161P
50 mL conical tube	SARSTEDT	62.547.254
AC adaptor for the light box	ATTO	2196161
Auto cell counter	DeNovix	CellDrop BF
CaCl2	Nakalai tesque	06731-05
Camera flash	NEWWER	TT560
Centrifuge	KUBOTA	2800
Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125	Chlamydomonas Resource Center		https://www.chlamycollection.org/
C-mout CCD camera	Wraymer	1129HMN1/3
Desktop darkroom	Scientex	B-S8
Digital still camera	SONY	RX100II
EGTA	Dojindo	G002
Fiji			https://fiji.sc/
Green LED plate	CCS	ISLM-150X150-GG
HCl	Fujifilm WAKO	080-01066
HEPES	Dojindo	GB70
KCl	Nakalai tesque	238514-75
Lightbox (Flat viewer)	ATTO	2196160
Microscope	Olympus	BX-53
Petri dish (φ3.5 cm)	IWAKI	1000-035
Pottasium acetate	Nakalai tesque	28434-25
Power supply for the green LED plate	CCS	ISC-201-2
Red filter	Shibuya Optical	S-RG630