Nos gustaría agradecer a nuestro asesor, el Dr. Eva Marder. Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones NS17813 a Eva Marder y NS059255 a AE T.

Antes de comenzar con este protocolo el estómago de la langosta debe ser retirado de los animales y como se describe en el artículo del compañero Jove (Bierman y Tobin, 2009). La mayoría de los pasos que se indican a continuación se realiza bajo un microscopio de disección. Parte I con aislamiento de los ganglios de la comisura <ol><li> Orientar el plato para que el extremo anterior (por el labio) es lejos de usted y el extremo posterior (por el píloro) es hacia usted. </li><li> Asegúrese de que el estómago se fija de modo que quede lo más plana posible en el plato. <ol><li> Pin por el esófago a ambos lados del labio. </li><li> Si es necesario, reorganice los otros pines colocados durante la disección bruto. </li></ol></li><li> Retire la hipodermis. <ol><li> Coge la hipodermis, cerca de la gm2/gm3 músculos, se desprenden de estos músculos y tire suavemente en la dirección anterior. </li><li> Separar la hipodermis de la grasa subyacente cortando las conexiones. Uso cada vez mayor atención alrededor de la arteria central, que encierra una parte clave del sistema nervioso stomatogastric. Salir de la hipodermis intacto dentro de un radio de 0,5 cm del ganglio stomatogastric, que se encuentra entre los músculos GM1b. </li><li> Cortar hipodermis separados. </li></ol></li><li> Separar el cerebro del tejido subyacente. <ol><li> Identificar a los dos grandes nervios comisurales que el proyecto bilateral de la parte anterior del cerebro de los ganglios de la comisura de la parte anterior del estómago. </li><li> Dejar intactos estos nervios, levante suavemente el cerebro con una pinza y se corta a separar el cerebro del resto de los tejidos. Tenga cuidado al hacer esto, como el nervio stomatogastric se encuentra debajo del cerebro y se debe mantener intacta. </li></ol></li><li> Aparte de los ganglios de la comisura de los alrededores de los tejidos. <ol><li> Siga uno de los nervios comisurales a uno de los ganglios de la comisura. </li><li> Identificar los iones y su hijo - estos nervios deben permanecer intactos. El ganglio comisural tendrá muchos nervios que irradian. Cortar la mayoría de ellos (excepto el ion e hijo), pero deja un nervio adicional adjunta para mantener el ganglio comisural en su lugar mientras usted termina la disección. </li><li> Repita con el ganglio comisural otros. </li></ol></li><li> Limpie el ion y el hijo de lateral a medial. Deja intacto el nervio vestibular para anclar el sistema nervioso en el estómago. El ganglio del esófago se sienta fueron los iones s se cruzan. Usted puede limpiar debajo de ella tomando el nervio inferior del ventrículo y tirando hacia arriba para cortar por debajo. </li></ol> Parte II-El aislamiento del ganglio Stomatogastric (STG) y los nervios restantes. <ol start="7"><li> Separar el STG de alrededor del tejido. <ol><li> El STG se encuentra dentro de una arteria que discurre entre los músculos GM1b y hasta el gm2a, b músculos. Busque el extremo del corte de la arteria cerca de la gm2a, b músculos. </li><li> Tire del extremo del corte de la arteria y la parte anterior, para exponer la DVN. Continuar tirando hacia arriba hasta llegar al nivel de la hipodermis restantes. Una vez separados, la arteria se puede recortar el nivel en el que toca la hipodermis restantes. </li><li> Cortar el colgajo del músculo que se encuentra en la tribuna de la langosta. </li><li> Levante la hipodermis encima de la arteria, al observar que la arteria que hace un túnel dentro de la grasa por encima de la STG. Ponga una hoja de las tijeras dentro de la arteria y corte el músculo por encima de ella. Compruebe que puede ver el dvn como se corta para estar seguro de que esté seguro, por encima de la STG. Continuar el corte anterior, a raíz de la arteria. Como se corta por encima de la STG, usted será capaz de ver la stn que emana la parte anterior de la STG y abajo de buceo en el músculo. Continuar el corte anterior de separar totalmente el músculo por encima del STG. </li><li> Borrar cualquier tejido fuera de la STN. </li></ol></li><li> Separar el s agn del tejido circundante. (Incluso si usted no va a grabar de la AGN, se necesita una parte del nervio intacto de precisar el ganglio de registros intracelulares.) <ol><li> Para ver mejor el s agn, retire el resto de la hipodermis y una capa fina de los músculos subyacentes. </li><li> Sólo por detrás de la STG, identificar a un túnel oscuro en el tejido adiposo y el músculo en cada lado de la DVN. </li><li> Palo una hoja de tijera en el interior del túnel y cortar el tejido sobre el nervio. Continuar el corte lateral, siguiendo el nervio, para aislarlo. (Un par de milímetros es suficiente para que fijando el ganglio, pero exponer al menos 5 mm de la AGN si va a grabar de ella.) </li><li> Separe la AGN de los músculos que inerva mediante la reducción de las conexiones. </li><li> Repetir en el otro lado para aislar el agn otros. </li><li> Una vez que ambos s AGN han sido disecados, cortar todos los músculos y el tejido que conecta el STG con el estómago. </li></ol></li><li> Aislar el s. mvn Son un par bilateral de los nervios pequeños se ramifican los LVN y atraviesa lateralmente por debajo de la grasa. <ol><li> O bien utilizar tijeras o pinzas de dos a cortar la grasa en un lado de la DVN, cerca de donde se bifurca en el s. dos LVN Aquí están lejos de la s mvn y no correrá el riesgo de cortarlos. </li><li> Levante la capa de grasa, e identificar la parte de abajo mvn pequeños. Estos nervios corren por dentro de lateral justo por detrás del nivel de los músculos GM1b. </li><li> Eliminar la capa de grasa por encima de la mvn, dejando el nervio intacto, por ahora lo que no se enrede. Que reducirá su extremo lateral de sobre el estómago, al final de la disección. </li><li> Repita el proceso en el otro lado para aislar el mvn otros. </li></ol></li><li> Aislar el s LVN y los nervios posteriores. <ol><li> A partir de la rama donde lvn s lateralmente fuera de la DVN, siga una LVN cortando la grasa por encima de ella. Dependiendo de la preparación, a veces toda la capa de grasa sobre el nervio se puede quitar. </li><li> Siguen revelando el LVN hasta el punto donde las ramas de PSN. </li></ol></li><li> Aislar el PYN. <ol><li> Localice el PYN, es un nervio que viajan atrás en el píloro. </li><li> Quitar la membrana delgada que cubre la región. </li><li> Aislar el PYN cortando una pequeña sección del píloro, que se adjunta a la PYN. </li><li> Levante con cuidado la sección pilórica y cortar el tejido en ambos lados de la PYN hasta llegar a la rama que se conecta al PDN. </li></ol></li><li> Aislar el PDN. <ol><li> Localice el PDN, que es un nervio que viajan atrás en el músculo dilatador del píloro. </li><li> Cortar una pequeña sección del músculo dilatador del píloro, que se adjunta al NPD. </li><li> Levante con cuidado la sección del músculo dilatador del píloro, cortar el tejido en ambos lados de la PDN, hasta llegar a la rama que se une a la PYN. </li></ol></li><li> Aislar el LVN ventral, que conecta el PYN y PDN, el LVN. <ol><li> En el punto de poder triangular donde el PDN PYN y conectar con el LVN ventral, aislar cualquier pequeña sección del nervio que sale de la LVN ventral, como el vpln. Este será utilizado como un identificador para tirar de la LVN ventral. </li><li> Levante el mango y cortar el tejido en ambos lados de la LVN ventral, trabajando en la dirección anterior hasta llegar al punto donde las ramas de PSN. </li></ol></li><li> Repita los pasos 10 a 13 para aislar los nervios LVN y posterior en el otro lado. </li><li> Separe el sistema nervioso stomatogastric del estómago. <ol><li> Para separar totalmente el LVN del estómago, tire de la psn y cortar todos los tejidos y nervios conectados a los LVN y LVN ventral, a excepción de la PDN y PYN. Repita este proceso en el otro lado. </li><li> Corte el extremo lateral de cada mvn. Levante el extremo lateral y cortar los archivos adjuntos extraños entre el nervio y el tejido del estómago subyacente. </li><li> En el extremo anterior, cortar los archivos adjuntos extraños a los ganglios de la comisura, y el corte del nervio vestibular de cada lado. </li><li> Visualmente escanear el sistema stomatogastric sistema nervioso para identificar y luego cortar los archivos adjuntos adicionales a los tejidos del estómago. </li><li> Agarrar el extremo anterior de ambos nervios comisurales, por encima de los ganglios de la comisura, y la cáscara del sistema nervioso stomatogastric fuera el estómago y moverlo a un lado del plato. Al hacer esto, cortar los archivos adjuntos restantes para liberar el sistema nervioso. </li></ol></li><li> Preparar el plato Sylgard pequeños. <ol><li> Aplicar un poco de tejido del estómago a fondo en la superficie de la Sylgard en el plato pequeño. Esto va a disminuir la hidrofobicidad de la Sylgard, por lo que la solución salina se distribuyen uniformemente a través de la antena. </li><li> Enjuagar y llenar el recipiente con solución salina refrigerada Sylgard. </li></ol></li><li> Transferir el sistema nervioso para el plato Sylgard preparado por el acaparamiento de los extremos anteriores de los nervios comisurales, el levantamiento del sistema nervioso del plato grande, y por la que en el plato pequeño. </li><li> Pin de la STNS en el plato pequeño con una combinación de los pines minuten y delgado pines corte de alambre de tungsteno. <ol><li> Asegúrese de que la preparación es la parte dorsal por la comprobación de que el nervio inferior del ventrículo está en dirección opuesta a la Sylgard. </li><li> Quitar el cerebro y el pin de los nervios comisurales. </li><li> Tire suavemente del sistema nervioso apretados y planos, tirando cada una de las s psn posterior y lateral, y la fijación hacia abajo. </li><li> Quitar el músculo dilatador del píloro del PDN, s, y el pin s. PDN </li><li> Quite elsegmento pilórica del PYN s, y el pin s. PYN </li><li> Precisar los nervios que quedan aislados, como los nervios labial, el s mvn y s. agn </li></ol></li><li> Desheath el STG. <ol><li> Asegúrese de que el STG es plana contra la Sylgard y mantiene tensa por el lateral s agn, la anterior y la stn dvn posterior. </li><li> Organizar la iluminación para permitir la visualización de los axones en el DVN. </li><li> Utilizando una aguja pequeña aguja de tungsteno o bien, hacer un pequeño agujero poco profundo en la vaina que rodea el DVN, justo por detrás del STG. </li><li> Saque la aguja a través de la DVN, dorsal a los axones, la creación de un desgarro horizontal en la vaina del nervio. </li><li> Agarrar la solapa de la vaina del nervio posterior a la STG y tire hacia delante para retirar la cubierta de la cara dorsal de la STG. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Abreviaturas: </td></tr><tr><td> STNS </td><td> Sistema nervioso Stomatogastric </td></tr><tr><td> STG </td><td> Ganglio Stomatogastric </td></tr><tr><td> COG </td><td> Ganglio comisural </td></tr><tr><td> stn </td><td> nervio stomatogastric </td></tr><tr><td> mvn </td><td> nervio medial ventricular </td></tr><tr><td> ion </td><td> los nervios del esófago inferior </td></tr><tr><td> hijo </td><td> los nervios del esófago superior, </td></tr><tr><td> agn </td><td> nervio gástrico anterior </td></tr><tr><td> dvn </td><td> nervio dorsal del ventrículo </td></tr><tr><td> LVN </td><td> nervio lateral del ventrículo </td></tr><tr><td> psn </td><td> los nervios del estómago posterior </td></tr><tr><td> vpln </td><td> ventral del nervio lateral posterior </td></tr><tr><td> PYN </td><td> nervio pilórica </td></tr><tr><td> PDN </td><td> nervio dilatador pilórica </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements.">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li><li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation.">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li><li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion:+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen.">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li><li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster,+Homarus+americanus.">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus,+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+(Decapoda+crustacean).">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li><li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+the+American+lobster.">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs.">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li><li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion.">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li><li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., F&#233;nelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture.">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li><li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals.">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li><li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression.">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li></ol>

La anatomía de la langosta y el estómago STNS ha sido bien descrita previamente 5,6, y las variaciones de este procedimiento la disección se han utilizado en numerosos estudios. Se recomienda familiarizarse con la anatomía del estómago 5-7 y STNS 5,8 antes de la disección de inicio. Esa familiaridad hace que disminuya el riesgo de daños accidentales sufridos por los nervios y los tejidos. Para mantener la salud de la preparación, es fundamental para mantener la preparación a una temperatura fresca. Esto se logra fácilmente mediante el intercambio de la solución salina cada 30 minutos con solución salina a 4 ˚ C conservarse en la nevera. Cuando se sumerge en una solución salina fría, el aislamiento de preparación STNS es viable por muchas horas. Grabaciones en relación Homarus gammarus han demostrado una actividad rítmica estable desde el STG lo largo de 5 días in vitro 9; robustez similar se ha visto en el H. americanus (obs. pers.). Modulador de entrada a la STG de los ganglios de la comisura es necesario para preservar los patrones motores en marcha. Por lo tanto, para mantener una actividad normal rítmica estos ganglios y el hijo de iones, y los nervios STN deben mantenerse intactos. La disección se describe conserva varios nervios motores (que contiene los axones de la neurona motora): el s AGN (con molino gástrico (GM) axones), el mvn s (que contiene lateral gástrico (LG) e Inferior axones cardiaca (IC)), el s PYN (que contiene las neuronas pilórica (PY) axones), el PDN s (que contiene Dilatador pilórica (PD) axones), y la s LVN (que contiene pilórica lateral (LP), gástrico medial (MG), los axones de GLP, así como los de GM, PD y PA). Mediante la disección de más (o diferente) los nervios, otros axones de neuronas motoras pueden ser grabadas. Cada tipo individual de la neurona motora axonal puede registrarse de forma individual mediante la disección y el registro de los nervios que inervan los músculos a los que ese tipo de proyectos de las neuronas. Esta preparación se puede utilizar para una variedad de estudios se centraron en la función del sistema nervioso. La actividad de las neuronas podrán ser grabadas con registros intracelulares, el electrodo afilado de somata o axones, o mediante el registro de los impulsos eléctricos extracelular de los nervios. Muchos canales de iones en las neuronas STG han sido parcialmente clonado y el ARNm se puede medir de forma manual sacó somata 10,11.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter)</td>
<td>Tool</td>
<td>California Fine Wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins.</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps #5</td>
<td>Tool</td>
<td>FST</td>
<td>91150-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minuten Pins</td>
<td>Tool</td>
<td>FST</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Moria Spring Scissors (7mm blades)</td>
<td>Tool</td>
<td>FST</td>
<td>15370-52</td>
<td>These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company.</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri Dish (100x15mm)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fischer</td>
<td>08-757-12</td>
<td>Fill 2-4mm with Sylgard 182.</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 182</td>
<td>Other</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>182</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pin Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>FST</td>
<td>26018-17</td>
<td>Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone.</td>
</tr>
<tr>
<td>Super fine forceps #5SF</td>
<td>Tool</td>
<td>FST</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten Needles</td>
<td>Tool</td>
<td>FST</td>
<td>10130-05</td>
<td>Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

homarus americanus stomatogastric nervous system dissection

Con el objetivo de comprender cómo los sistemas nervioso produce la actividad y responder al medio ambiente, los neurocientíficos a su vez a los sistemas modelo que muestra la actividad de interés y son accesibles y susceptibles a los métodos experimentales. El sistema nervioso stomatogastric (STNS) de la langosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;, También se sabe que la langosta del Atlántico o Maine) se ha establecido como un sistema modelo para estudiar el ritmo de generación de redes y la neuromodulación de las redes. El STNS consta de 3 ganglios anterior (2 ganglios comisural y un ganglio esofágicas), que contiene neuronas moduladoras que el proyecto de forma centralizada para el ganglio stomatogastric (STG). El STG contiene aproximadamente 30 neuronas que forman dos redes centrales de patrones de generación, las redes de píloro gástrico y que subyacen a los comportamientos de alimentación de los crustáceos<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Si bien es posible estudiar este sistema<i&gt; In vivo</i<sup&gt; 3</sup&gt;, El STNS sigue produciendo su actividad rítmica cuando se aíslan<i&gt; In vitro</i&gt;. El aislamiento físico de los STNS en un plato permite un fácil acceso a los cuerpos celulares en los ganglios de los registros electrofisiológicos intracelulares y los nervios de la STNS para las grabaciones extracelular. Aislar el STNS es un proceso de dos partes. La primera parte, la disección del estómago de los animales, se describe en un artículo de video que lo acompaña<sup&gt; 4</sup&gt;. En este artículo de vídeo, las técnicas de disección finas se utilizan para aislar el STNS del estómago. Este procedimiento da como resultado una preparación del sistema nervioso que está disponible para los registros electrofisiológicos.

Watch this Scientific Journal Video about Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection at JoVE.com

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Se describe la disección fina del sistema nervioso stomatogastric del estómago de la langosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;).

Homarus americanus Stomatogastric La disección del sistema nervioso

With the goal of understanding how nervous systems produce activity and respond to the environment, neuroscientists turn to model systems that exhibit the ...

homarus-americanus-stomatogastric-nervous-system-dissection

Research

JoVE Journal

Biology

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

11.1K vistas.  Brandeis. Se describe la disección fina del sistema nervioso stomatogastric del estómago de la langosta americana ( Homarus americanus).

Video: Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Dissection of Drosophila Ovaries

La disección de los ovarios Drosophila

Investigación

Biología

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

La disección de embriones de ratón 6,5 dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the immune response to an infection of the CNS, such as poliomyelitis, Lyme neuroborreliosis, or neurosyphilis, it is often necessary to isolate the CNS-infiltrating immune cells.
In this video-protocol we demonstrate how to isolate mononuclear cells (MNCs) from the CNS of a rat with EAE. The first step of this procedure requires a cardiac perfusion of the rodent with a saline solution to ensure that no blood remains in the blood vessels irrigating the CNS. Any blood contamination will artificially increase the number of apparent CNS-infiltrating MNCs and may alter the apparent composition of the immune infiltrate. We then demonstrate how to remove the brain and spinal cord of the rat for subsequent dilaceration to prepare a single-cell suspension. This suspension is separated on a two-layer Percoll gradient to isolate the MNCs. After washing, these cells are then ready to undergo any required procedure. 
Mononuclear cells isolated using this procedure are viable and can be used for electrophysiology, flow cytometry (FACS), or biochemistry. If the technique is performed under sterile conditions (using sterile instruments in a tissue culture hood) the cells can also be grown in tissue culture medium. A given cell population can be further purified using either magnetic separation procedures or a FACS.

In this video we demonstrate how to isolate mononuclear cells from the central nervous system of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis.

Aislamiento de células mononucleares de la del sistema nervioso central de ratas con EAE

Whether studying an autoimmune disease directed to the central nervous system (CNS), such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE, 1), or the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larval NMJ Disección

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

Cáncer de Borealis Stomatogastric disección del sistema nervioso

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

La disección bruto del estómago de la langosta, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

La disección y la tinción de Drosophila Larvas Ovarios

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...