Comience colocando las secciones del cerebro fijadas en formol e incrustadas en parafina en platos con tapas de rosca. Coloque la solución de apagado en los platos, cúbralos con papel de aluminio e incube a cuatro grados centígrados mientras agita durante un día. Al día siguiente, transfiera todas las muestras a nuevas placas e incorpórelas con la solución de encendido como se muestra anteriormente.
Al final de la incubación, coloque las muestras en tubos y lávelas tres veces con PBS durante dos horas mientras agita. A continuación, añada solución de inactivación a las muestras e incube durante la noche en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de realizar tres lavados, agregue una solución de aclarado a las muestras e incube en un baño de agua a 55 grados centígrados durante tres a siete días.
Al final de la incubación, lavar las muestras con PBST a 37 grados centígrados durante tres horas en una incubadora. Al día siguiente, agregue 10 mililitros de peróxido de hidrógeno al 30% a cada muestra y lave las muestras tres veces con PBS durante 10 minutos mientras agita a temperatura ambiente. A continuación, precaliente la solución de recuperación de antígenos a 95 grados centígrados en un baño de agua.
Transfiera las muestras a la solución calentada e incube a 95 grados centígrados durante 10 minutos, seguidos de 40 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Lave las muestras con agua desionizada durante cinco minutos mientras agita. Equilibre las muestras en PBS.
Ahora transfiera las muestras a platos con tapas de rosca. Después de preparar una solución fresca de anticuerpos primarios para todas las muestras en un vaso de precipitados, agréguela a las muestras e incube a 37 grados centígrados durante uno a siete días agitando suavemente en la oscuridad. A continuación, coloque las muestras en tubos y lávelas con PBST precalentado a 37 grados centígrados en la incubadora.
Trasladar las muestras a platos con tapas de rosca y añadir anticuerpos secundarios preparados en PBST y azida sódica al 0,01%. Transfiera las muestras a tubos y lávelas con PBST precalentado tres veces a 37 grados centígrados durante dos horas mientras agita. Para la coincidencia del índice de refracción, coloque las muestras en placas nuevas y agregue una solución al 30% de TDE.
A continuación, sustituya la solución al 30 % de TDE por una solución al 68 % de TDE en las muestras y déjelas a temperatura ambiente mientras agita. Después del corto procesamiento, se logró una transparencia óptima y homogénea de todos los cortes de tejido tanto en materia gris como blanca.
