Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Reproduktion zu beantworten. Und die Endokrinologie. Und gelten für die Studie des Polyzystischen Ovar-Syndroms oder PCOS und Hyperandrogenismus.
Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie eine konsistente, einheitliche, langfristige Freisetzung von Hormonen auf kostspielige effektive Weise ermöglicht. JHUs, die das Verfahren behandeln, werden Ping Xue, ein Techniker aus meinem Labor sein. Für Dihydrotestosteron oder DHT-Pellet-Vorbereitung, verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein 15-Millimeter-Stück Silikonschläuche zu schneiden.
Und verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer abgestumpften 20-Spur-Nadel, um zwei bis fünf Millimeter medizinisches Klebstoffsilikon in ein Ende des Rohres zu injizieren. Lassen Sie die Schläuche über Nacht trocknen. Und überprüfen Sie auf Luftblasen am versiegelten Ende.
Das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung gießt DHT-Pulver in ein Plastik-Wegboot in der Fließhaube. Beeindrucken Sie das geöffnete Ende des klebebedeckten Rohres in das Pulver. Mit einer großen begradigten Büroklammer das Pulver in den Schlauch stampfen, bis das DHT die entsprechende experimentelle Tiefe erreicht.
Dann versiegeln Sie die geöffnete Seite des Rohres über Nacht mit Silikon. Am nächsten Morgen schneiden Sie jede versiegelte Seite, um eine zwei Millimeter lange Silikonlänge auf beiden Seiten des DHT und keine DHT-Kontrollpellets zu erhalten. Dann die Pellets in dem 50 Milliliter konischen Rohr mit Folie bei Raumtemperatur für bis zu drei Monate verpackt lagern.
Für pcOS Mausmodellgeneration Equilibrate bis zu 20 DHT oder Steuerpellets in separaten 50 Milliliter konische Röhren mit 30 Milliliter n.0,9 Prozent Saline für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag bestätigen Sie die fehlende Reaktion auf Zehenkneifen in einer zwei Monate alten weiblichen Maus und verwenden Sie sterile Gaze, um sequenzielle povidone-Jod und 70 Prozent Ethynolpeelings in den chirurgischen Bereich zu verabreichen. Als nächstes machen Sie einen fünf Millimeter Schnitt durch die Haut in der Nähe des Halses.
Und verwenden Sie einen zehnSpurwagen, um einen 15-Millimeter-Tunnel in rostraler Richtung zu bauen. Verwenden Sie den Trokar, um ein Pellet dorsal in den Tunnel einzufügen und den Schnitt mit dem chirurgischen Klebstoff zu versiegeln. Die Wundkanten mit Zangen manuell annähern und mit sanften Bürstenschlägen drei dünnschichtige Schichten flüssigen Klebstoffs auf einen Zentimeter von jeder Seite der entgegengesetzten Wundkanten auftragen.
Dann legen Sie die Maus allein in einem Käfig auf einem Heatpad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Ersetzen sie das Pellet alle vier Wochen, um ein konstantes Androgen-Expositionsniveau aufrechtzuerhalten. Drei Tage nach dem Einsetzen von Pellets verwenden Sie eine p10-Pipette, um zehn Mikroliter steriler Saline in die Vaginalhöhle zu spritzen und die Pipettespitze zu verwenden, um die Saline sofort wiederherzustellen.
Verteilen Sie die vaginale Zell-Saline-Probe auf eine beschriftete Folie. Und lassen Sie die Saline bei Raumtemperatur trocknen. Fixieren Sie die getrockneten Dias in einem Behälter von 100 Prozent Ethynol für mindestens fünf Minuten.
Dann färben Sie die Dias für jeweils eine Minute in Puffer B und Puffer C aus einem dif-schnellen Färbekit. Am Ende des Puffers C inkubieren Sie die Dias drei Sekunden lang mit Leitungswasser waschen und bei Raumtemperatur trocknen. Um die estre Zyklizität zu bestimmen, betrachten Sie die Dias unter dem zehnfachen Ziel eines Lichtmikroskops.
Zählen Sie die Tage in jeder Phase und dividieren Sie durch die Gesamtzahl der Tage, um die Prozentzeit in jeder Phase zu berechnen. Um die Glukosetoleranz zu testen, 20 Tage DHT-Einfügung, fasten Sie die Mäuse über Nacht. Wiegen Sie die Mäuse am nächsten Morgen, und verwenden Sie ein Glukometer und Teststreifen, um Basilikum Glukosespiegel der Schwanzvene Blut zu messen.
Injizieren Sie die Mäuse mit zwei Gramm pro Kilogramm Körpergewicht von 20 Prozent Dextrose. Dann messen Sie den Glukosespiegel der Schwanzvenenblutproben bei 15, 30, 60, 90, 120 Minuten nach dextrose Verabreichung. Um weibliche Nachkommen von DHT eingesetzten Damen zu erwerben, bewegen Sie die weibliche Maus, um im Käfig mit einem nachgewiesenen fruchtbaren Männchen an Tag 15 getestet, nach Pellet-Einfügung.
Dokumentieren Sie das Körpergewicht der Dame jede Woche, um festzustellen, ob die Maus schwanger ist. Tauchen Sie am siebten Tag eine Lanzenspitze in Tattoopaste und markieren Sie jeden Welpen mit einem Tattoo auf der Zeh. Wiegen Sie die markierten Mäuse alle sieben Tage bis zum 70. Lebensjahr.
Zwischen dem postnatalen Datum 12 bis 16, Ohr schlagen die Mäuse, um sie nach dem System zu nummerieren, wie in der Abbildung dargestellt. Um das Geschlecht zu unterscheiden, untersuchen Sie die ventrale Seite jeder markierten Maus. Die Weibchen werden sichtbare Brustwarzen haben.
Um Blutproben für verschiedene nachgeschaltete Analysen zu sammeln, verwenden Sie eine Lanze, um das ungefähre experimentelle Blutvolumen zwischen neun und zehn Uhr durch submandibuläre Venenblutungen zu sammeln. Und zentrifugieren Sie die Proben, um serum sammlung zu ermöglichen. Dann lagern Sie die Serenproben in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren bei minus 80 Grad Celsius bis zu ihrer Analyse.
Um die Pubertät in den weiblichen Nachkommen des DHT zu beurteilen, überprüfen Sie jeden Tag nach der Entwöhnung am 21. Tag die vaginale Öffnung durch visuelle Inspektion. Und verwenden Sie Kaliber, um den anogenitalen Abstand zu messen. Obwohl die absoluten Werte des Serums DHT zwischen Massenspektrometrie und Elisa-Analyse unterschiedlich sind, ist die relative Volksveränderung von DHT im Vergleich zur No-DHT-Einfügung sowohl von Assays als auch von Experimenten hinweg ähnlich.
DHT-Spiegel sind von der Vorkonzeption bis zur Schwangerschaft sowohl bei DHT- als auch bei keinen DHT-Mäusen signifikant erhöht. Allerdings sind die DHT-Spiegel bei DHT-Mäusen doppelt höher als bei keinen DHT-Mäusen sowohl bei präkonzeptionalen als auch bei gestationalen Zeitpunkten. Erwachsene DHT-Töchter weisen Unterschiede in der Fortpflanzungsfunktion auf.
Zum Beispiel, gestörte esestrous Zyklizität im Vergleich zu erwachsenen keine DHT-Töchter erleben deutlich längere Zeiten in Metestrus Diestrus und weniger Zeit in pro-esterous und esterous. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Pellets für 24 Stunden zu inkubieren, bevor sie für die gleichmäßige Freisetzung des Hormons verwendet werden. Nach diesem Verfahren können auch die reproduktiven und metabolischen Folgen einer DHT-Exposition untersucht werden.
Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Endrochronologie und mütterlichen fetalen Interaktionen, um PCOS und die Auswirkungen von Hyperandrogenismus auf niedrigem Niveau bei weiblichen Mäusen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DHT extrem gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer Maske und Einer Brille sowie das Arbeiten in einer Biosicherheitshaube immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
