Este método puede ayudar a responder preguntas en el diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung. El método y las funciones de esta técnica, si sigue el protocolo, exhiben alta sensibilidad y las tasas de especificidad que se procesan al mismo tiempo. Demostrando el procedimiento estará Mijing Fang, un técnico de mi laboratorio.
Comience por fijar las biopsias de succión rectal en cinco veces el volumen del tejido en 4%paraformaldehído durante seis horas a temperatura ambiente. Deshidratar los tejidos fijos en un deshidratador de tejido patológico durante 11 horas e incrustar los tejidos de biopsia de succión rectal procesados en bloques de parafina. Recorte los bloques de un microtoma hasta que se exponga un plano de sección completo del tejido.
A continuación, utilice el microtoma para obtener una sección de 0,4 micrómetros del tejido incrustado. Colocar en 45 a 50 grados Celsius agua para permitir que las secciones se propaguen en un plano plano. Transfiera las secciones aplanadas en toboganes de vidrio y hornéelos en un horno Celsius de 60 grados durante tres a cinco horas.
Coloque los portaobjetos desparafinados en dos cambios de xileno de 15 minutos seguidos de su hidratación en inmersiones secuenciales de etanol de cinco minutos. A continuación, enjuague los portaobjetos con agua purificada de ósmosis inversa durante cinco minutos adicionales. Para la recuperación de antígenos, coloque los portaobjetos en un frasco de tinción de Coplin de solución de recuperación y coloque el frasco en un baño precalentado de agua hirviendo.
Después de 20 minutos, deje que el frasco se enfríe a temperatura ambiente durante unos 10 minutos y enjuague suavemente los portaobjetos con PBS. Luego usa un marcador hidrófobo para rodear cada sección del tejido y coloca los portaobjetos en una caja húmeda. Para bloquear cualquier peroxida, agregue dos o tres gotas de 3% de solución de peróxido de hidrógeno en cada tejido y coloque los portaobjetos a 37 grados Celsius durante 20 minutos.
Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos con tres lavados PBS de cinco minutos seguidos de bloqueo con albúmina sérica bovina al 5% durante 20 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, deseche el exceso de albúmina sérica bovina y etiquete las células con 50 microlitros del anticuerpo primario de interés a 4 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, enjuague los portaobjetos con tres lavados de tres minutos en PBS y agregue 50 microlitros de potenciador de polímero a cada diapositiva.
Después de 20 minutos a 37 grados Centígrados, lave las diapositivas tres veces en PBS y agregue 50 microlitros de anticuerpo secundario B a cada sección del tejido. Después de 30 minutos a 37 grados centígrados, enjuague las secciones con tres lavados de cinco minutos en PBS y agregue una gota de solución de trabajo DAB recién preparada a cada diapositiva. Cuando se detecte el nivel adecuado de tinción marrón mediante microscopía ligera, enjuague los portaobjetos en PBS durante cinco minutos y manche los núcleos con una gota de hematoxilina durante un minuto.
Retire el exceso de mancha bajo un goteo de agua durante aproximadamente 30 a 40 segundos seguido de un lavado de 25 a 30 segundos en PBS fresco. Diferencie los tejidos en etanol ácido clorhídrico al 1% durante 10 segundos seguido de un lavado PBS de un minuto. Deshidrata los portaobjetos con inmersiones de cinco minutos en el orden inverso de hidratación y expone los portaobjetos a dos cambios de xileno de cinco minutos.
A continuación, monte el resbalón de la cubierta con un montaje ultra limpio y deje que las diapositivas se sequen antes de su visualización en un microscopio de luz. En este estudio representativo de 318 pacientes con biopsia de sección rectal, 99 pacientes fueron diagnosticados inicialmente por biopsia de sección rectal. Se observaron muchas células ganglionares que expresan calretinin en biopsias de tejido normal.
Sin embargo, no se detectaron células ganglionares en ninguna zona del tejido de los segmentos de la enfermedad de Hirschsprung. La inmunostaining S-100 y PGP9.5 reveló troncos nerviosos hipertrofiados en la submucosa del tejido enfermo con sólo tinción granular de algunas ramas del nervio pequeño observadas en el intestino normalmente internado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar prestar atención a detalles como el tamaño de las biopsias de succión rectal y el grosor de las secciones.
Después de que se desfragmente, esta técnica allanará el camino para las investigaciones en el campo de la cirugía pediátrica para apoyar un diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung.
