Diese Methode kann helfen, Fragen bei der Diagnose der Hirschsprung-Krankheit zu beantworten. Die Methode und Funktionen dieser Technik, wenn Sie Protokoll folgen, weist eine hohe Empfindlichkeit und die Spezifitätsraten, die gleichzeitig prozessieren. Demonstriert wird das Verfahren von Mijing Fang, einem Techniker aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Fixierung der rektalen Saugbiopsien in fünfmal dem Volumen des Gewebes in 4%Paraformaldehyd für sechs Stunden bei Raumtemperatur. Dehydrieren Sie das fixierte Gewebe 11 Stunden lang in einem pathologischen Gewebedehydrator und betten Sie das verarbeitete rektale Saugbiopsiegewebe in Paraffinblöcke ein. Schneiden Sie die Blöcke auf einem Mikrotom, bis eine vollständige Schnittebene des Gewebes exponiert ist.
Verwenden Sie dann das Mikrotome, um einen 0,4 Mikrometer Abschnitt des eingebetteten Gewebes zu erhalten. Platzieren Sie 45 bis 50 Grad Celsius Wasser, damit sich die Abschnitte in einen flachen Plan ausbreiten können. Die abgeflachten Abschnitte auf Glasrutschen übertragen und drei bis fünf Stunden in einem 60 Grad Celsius Ofen backen.
Platzieren Sie die deparaffinisierten Dias in zwei 15-minütige Xylolwechsel, gefolgt von ihrer Hydratation in sequenziellen fünfminütigen Ethanol-Eintauchen. Dann spülen Sie die Dias in Umkehrosmose gereinigtes Wasser für weitere fünf Minuten. Für die Antigen-Retrieval, legen Sie die Dias in einem Coplin Färbung Glas der Retrieval-Lösung und legen Sie das Glas in ein vorgeheiztes Bad mit kochendem Wasser.
Nach 20 Minuten das Glas ca. 10 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen lassen und die Dias vorsichtig mit PBS abspülen. Verwenden Sie dann einen hydrophoben Marker, um jeden Gewebeabschnitt einzukreisen und die Dias in eine nasse Box zu legen. Um Peroxidate zu blockieren, fügen Sie zwei oder drei Tropfen 3% Wasserstoffperoxidlösung auf jedes Gewebe und legen Sie die Dias bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.
Am Ende der Inkubation spülen Sie die Dias mit drei fünfminütigen PBS-Washes, gefolgt von einer Blockierung mit 5% Rinderserumalbumin für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes entsorgen Sie das überschüssige Rinderserumalbumin und beschriften Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern des primären Interessierenden Antikörpers bei 4 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen spülen Sie die Dias mit drei dreiminütigen Wähbern in PBS und fügen Sie 50 Mikroliter Polymerenhancer zu jedem Dia hinzu.
Nach 20 Minuten bei 37 Grad Celsius die Dias dreimal in PBS waschen und 50 Mikroliter Sekundärantikörper B zu jedem Gewebeabschnitt hinzufügen. Nach 30 Minuten bei 37 Grad Celsius die Abschnitte mit drei fünfminütigen Währen in PBS abspülen und jedem Dia einen Tropfen frisch zubereitete DAB-Arbeitslösung hinzufügen. Wenn der entsprechende Grad der braunen Färbung durch Lichtmikroskopie erkannt wird, spülen Sie die Dias in PBS für fünf Minuten und gegen flecken die Kerne mit einem Tropfen Hämatoxylin für eine Minute.
Entfernen Sie den überschüssigen Fleck unter einem Rinnsal von Wasser für etwa 30 bis 40 Sekunden, gefolgt von einer 25 bis 30 Sekunden Waschen in frischen PBS. Differenzieren Sie die Gewebe in 1%Salzsäure-Ethanol für 10 Sekunden, gefolgt von einer einminütigen PBS-Wäsche. Dehydrieren Sie die Dias mit fünfminütigen Eintauchen in die umgekehrte Reihenfolge der Hydratation und setzen Sie die Dias zwei fünfminütigen Xylolwechseln aus.
Montieren Sie dann den Deckelschlupf mit ultrasauberer Montage und lassen Sie die Dias vor ihrer Visualisierung auf einem Lichtmikroskop trocknen. In dieser repräsentativen Studie mit 318 rektalen Sektionsbiopsiepatienten wurden 99 Patienten zunächst durch rektale Sektionsbiopsie diagnostiziert. Viele Ganglienzellen, die Calretinin exprimieren, wurden in normalen Gewebebiopsien beobachtet.
In keinem Bereich des Gewebes aus den Hirschsprung-Krankheitssegmenten wurden jedoch Ganglienzellen nachgewiesen. S-100 und PGP9.5 Immunostainierung zeigte hypertrophierte Nervenstämme in der Submukose des erkrankten Gewebes mit nur körniger Färbung einiger kleiner Nervenzweige, die im normalerweise innervierten Darm beobachtet wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, auf Details wie größe der rektalen Saugbiopsien und Dicke der Abschnitte zu achten.
Nach der Defragmentierung wird diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der Kinderchirurgie ebnen, um eine Diagnose der Hirschsprung-Krankheit zu unterstützen.
