この方法は、ヒルシュスプルング病の診断における質問に答えるのに役立ちます。この手法の方法と機能は、プロトコルに従えば、高い感度と同時に処理する特異度率を示します。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるMijing Fangです。
直腸吸引生検を室温で6時間4%パラホルムアルデヒドで組織の体積の5倍に固定します。11時間、病理学的組織脱水機で固定組織を脱水し、パラフィンブロックに処理された直腸吸引生検組織を埋め込む。組織の完全な断面が露出するまでミクロトーム上のブロックをトリミングします。
その後、ミクロトームを使用して、埋め込まれた組織の0.4マイクロメートルの切片を得る。45〜50度の摂氏水に入れ、セクションを平らな計画に広げます。平らにしたセクションをガラススライドに移し、60度の摂氏オーブンで3〜5時間焼きます。
脱パラフィンスライドを2つの15分間のキシレンの変化に入れ、続いてその水和を5分間のエタノール浸漬で入れる。その後、さらに5分間逆浸透精製水でスライドをすすきます。抗原を取り出す場合は、コプリン染色用の回収液の瓶にスライドを入れ、熱湯の予熱浴に瓶を入れます。
20分後、瓶を室温まで約10分間冷やし、PBSでスライドをそっと洗いすします。その後、疎水性マーカーを使用して各組織セクションを囲み、スライドを濡れた箱に入れます。ペルオキシデートをブロックするには、各組織に3%過酸化水素溶液を2〜3滴加え、スライドを摂氏37度で20分間置きます。
インキュベーションの最後に、3つの5分間のPBSのスケでスライドをすすぐ後、5%のウシ血清アルブミンを摂氏37度で20分間ブロックします。次に、余分なウシ血清アルブミンを捨て、一晩摂氏4度で目的の一次抗体の50マイクロリットルで細胞にラベルを付けます。翌朝、PBSで3分間の3分間のスケでスライドをすすい、各スライドに50マイクロリットルのポリマーエンハンサーを加えます。
摂氏37度で20分後、スライドをPBSで3回洗浄し、各組織セクションに50マイクロリットルの二次抗体Bを加える。30分摂氏37度で、PBSで3回の5分間のスケでセクションをすすい、各スライドに準備したDAB作業ソリューションを一滴追加します。適切なレベルの褐色染色が光顕微鏡で検出された場合、PBSでスライドを5分間リンスし、ヘマトキシリンを1滴ずつ副染色します。
水のトリクルの下で余分な汚れを約30〜40秒間取り除き、その後新鮮なPBSで25〜30秒の洗浄を行います。1%塩酸エタノールで組織を10秒間分化し、その後1分間のPBS洗浄を行います。水分補給の逆の順序で5分間の浸漬でスライドを脱水し、2つの5分間の変更キシレンにスライドを露出させます。
次に、超クリーンな取り付けを使用してカバースリップを取り付け、スライドが光顕微鏡で視覚化される前に乾燥させます。318人の直腸セクション生検患者の本代表的な研究では、99人の患者が最初に直腸部生検によって診断された。カレチニンを発現する多くのガングリオン細胞が正常組織生検で観察された。
しかし、ヒルシュスプルング病のセグメントから組織のどの領域にも神経節細胞は検出されなかった。S-100およびPGP9.5免疫染色は、通常の内インナート腸で観察されたいくつかの小さな神経小枝の粒状染色のみを伴う疾患組織の粘膜下の肥大性神経幹を明らかにした。この手順を試みる間、直腸吸引生検のサイズやセクションの厚さなどの細部に注意を払うことを忘れないでください。
それが最適化された後、この技術は、ヒルシュスプルング病の診断をサポートするために小児外科の分野での研究のための道を開きます。
