Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande nella diagnosi della malattia di Hirschsprung. Il metodo e le funzioni di questa tecnica, se si segue il protocollo, mostrano un'elevata sensibilità e i tassi di specificità che elaborano contemporaneamente. A dimostrare la procedura sarà Mijing Fang, un tecnico del mio laboratorio.
Iniziare fissando le biopsie di aspirazione rettale in cinque volte il volume del tessuto in paraformaldeide al 4% per sei ore a temperatura ambiente. Disidratare i tessuti fissi in un disidratatore patologico del tessuto per 11 ore e incorporare i tessuti di biopsia di aspirazione rettale trasformati in blocchi di paraffina. Tagliare i blocchi su un microtomo fino a quando non viene esposto un piano di sezione completo del tessuto.
Quindi utilizzare il microtomo per ottenere una sezione di 0,4 micrometri del tessuto incorporato. Posizionare in acqua da 45 a 50 gradi Celsius per consentire alle sezioni di diffondersi in un piano piatto. Trasferire le sezioni appiattite su vetrini e cuocerle in forno a 60 gradi Celsius per tre o cinque ore.
Posizionare le diapositive deparaffinizzate in due cambi di 15 minuti di xilene seguiti dalla loro idratazione in immersioni sequenziali di etanolo di cinque minuti. Quindi sciacquare gli scivoli in acqua purificata dall'osmosi inversa per altri cinque minuti. Per il recupero dell'antigene, posizionare gli scivoli in un barattolo di soluzione di recupero coplin e posizionare il barattolo in un bagno preriscaldato di acqua bollente.
Dopo 20 minuti, lasciare raffreddare il barattolo a temperatura ambiente per circa 10 minuti e sciacquare delicatamente gli scivoli con PBS. Quindi utilizzare un marcatore idrofobico per circondare ogni sezione di tessuto e posizionare le diapositive in una scatola bagnata. Per bloccare eventuali perossidati, aggiungere due o tre gocce di soluzione di perossido di idrogeno al 3% su ogni tessuto e posizionare le diapositive a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Al termine dell'incubazione, sciacquare le diapositive con tre lavaggi PBS di cinque minuti seguiti da blocco con albumina siere bovina al 5% per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, scartare l'albumina del siero bovino in eccesso ed etichettare le cellule con 50 microlitri dell'anticorpo primario di interesse a 4 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, sciacquare le diapositive con tre lavaggi di tre minuti in PBS e aggiungere 50 microlitri di esaltatore polimerico ad ogni diapositiva.
Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius, lavare le diapositive tre volte in PBS e aggiungere 50 microlitri di anticorpo secondario B a ogni sezione tissutale. Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius, sciacquare le sezioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS e aggiungere una goccia di soluzione di lavoro DAB preparata al momento ad ogni diapositiva. Quando il livello appropriato di colorazione marrone viene rilevato mediante microscopia leggera, sciacquare le diapositive in PBS per cinque minuti e contromaminare i nuclei con una goccia di ematossilina per un minuto.
Rimuovere la macchia in eccesso sotto un rivolo d'acqua per circa 30-40 secondi seguita da un lavaggio da 25 a 30 secondi in PBS fresco. Differenziare i tessuti in etanolo all'1% di acido cloridrico per 10 secondi seguito da un lavaggio PBS di un minuto. Disidratare le diapositive con immersioni di cinque minuti nell'ordine inverso di idratazione ed esporre le diapositive a due cambi di cinque minuti di xilene.
Quindi montare lo slittamento del coperchio utilizzando un montaggio ultra-pulito e lasciare asciugare le diapositive prima della visualizzazione su un microscopio leggero. In questo studio rappresentativo su 318 pazienti con biopsia a sezione rettale, 99 pazienti sono stati inizialmente diagnosticati dalla biopsia della sezione rettale. Molte cellule gangliari che esprimono calretinina sono state osservate in normali biopsie tissutali.
Tuttavia, non sono state rilevate cellule gangliari in nessuna area del tessuto dai segmenti della malattia di Hirschsprung. L'immunostaining S-100 e PGP9.5 ha rivelato tronchi nervosi ipertrofi nella sottomucosa del tessuto danneggiato con solo colorazione granulare di alcuni piccoli ramoscelli nervosi osservati nell'intestino normalmente innervato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione a dettagli come le dimensioni delle biopsie di aspirazione rettale e lo spessore delle sezioni.
Dopo essere stata deframmentata, questa tecnica aprirà la strada alle ricerche nel campo della chirurgia pediatrica per sostenere una diagnosi della malattia di Hirschsprung.
