Bu yöntem Hirschsprung hastalığının tanısında soruları n yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin yöntemi ve işlevleri, protokolü izlerseniz, yüksek hassasiyet ve aynı anda işleyen özgüllük oranları sergiler. Prosedürü gösteren Mijing Fang, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.
Rektal emme biyopsilerini oda sıcaklığında altı saat boyunca %4 paraformaldehitte dokunun hacminin beş katı olarak sabitleyerek başlayın. Patolojik doku dehidratöründeki sabit dokuları 11 saat boyunca kurutun ve işlenmiş rektal emme biyopsi dokularını parafin bloklarına gömün. Doku tam bir kesit düzlemi maruz kalana kadar bir mikrotom üzerinde blokları kırpın.
Daha sonra gömülü dokunun 0,4 mikrometrelik bölümlerini elde etmek için mikrotomu kullanın. Bölümlerin düz bir plana yayılmasını sağlamak için 45 ila 50 derece santigrat su yerleştirin. Düzleştirilmiş bölümleri cam kaydıraklara aktarın ve 60 derecelik bir fırında 3-5 saat pişirin.
Deparafinize slaytları iki 15 dakikalık ksilen değişikliklerine yerleştirin ve ardından hidrasyonlarını sıralı beş dakikalık etanol daldırmalarına yerleştirin. Daha sonra ters ozmoz saf su slaytlar durulayın ek bir beş dakika. Antijen alımı için, alma çözeltisi bir Coplin boyama kavanozuna slaytlar yerleştirin ve kaynar su önceden ısıtılmış bir banyo içine kavanoz yerleştirin.
20 dakika sonra, kavanozun oda sıcaklığına kadar soğumasını yaklaşık 10 dakika bekleyin ve slaytları PBS ile hafifçe durulayın. Sonra her doku bölümü çevreleyen ve ıslak bir kutu içine slaytlar yerleştirmek için bir hidrofobik marker kullanın. Herhangi bir peroksiti engellemek için, her doku üzerine %3 hidrojen peroksit çözeltisi iki veya üç damla ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derece slaytlar yerleştirin.
Kuluçka sonunda, üç beş dakikalık PBS yıkayarak slaytları durulayın ve ardından 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca %5 büyükbaş serum albumini bloke edin. Daha sonra, fazla sığır serum albumin atın ve 4 derece santigrat bir gecede ilgi birincil antikor 50 mikrolitre ile hücreleri etiketleyin. Ertesi sabah, PBS üç üç dakikalık yıkıntı ile slaytlar durulayın ve her slayt polimer arttırıcı 50 mikrolitre ekleyin.
37 santigrat derecede 20 dakika sonra, PBS'de slaytları üç kez yıkayın ve her doku bölümüne 50 mikrolitre ikincil antikor B ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika sonra, PBS üç beş dakikalık yıkıntı ile bölümleri durulayın ve her slayt için taze hazırlanmış DAB çalışma çözümü bir damla ekleyin. Işık mikroskopisi ile uygun kahverengi boyama seviyesi tespit edildiğinde, PBS'deki slaytları beş dakika durulayın ve çekirdekleri bir dakika hematoksilin damlasıyla lekeleyin.
Yaklaşık 30 ila 40 saniye boyunca bir damla su altında fazla leke çıkarın ve taze PBS 25-30 saniye yıkama. 10 saniye boyunca % 1 hidroklorik asit etanol dokuları ayırt ve bir dakika PBS yıkama takip. Hidrasyon ters sırayla beş dakikalık daldırma ile slaytlar dehydrate ve ksilen iki beş dakikalık değişiklikler slaytlar maruz.
Daha sonra ultra temiz montaj kullanarak kapak kayma monte ve hafif bir mikroskop üzerinde görselleştirme önce slaytlar kurumasını bekleyin. 318 rektal kesitbiyopsi hastasının katıldığı bu temsilci çalışmada 99 hastaya ilk olarak rektal kesit biyopsisi tanısı konuldu. Normal doku biyopsilerinde kalretinin ilerlediği birçok ganglion hücresi gözlendi.
Ancak, Hirschsprung hastalığı segmentlerinden doku herhangi bir alanda ganglion hücreleri tespit edildi. S-100 ve PGP9.5 immünboyama normal innerve bağırsakta gözlenen bazı küçük sinir dalları sadece granüler boyama ile hastalıklı dokunun submukozasında hiperkupak sinir gövdeleri ortaya. Bu işlemi denerken rektal emme biyopsilerinin boyutu ve kesit kalınlığı gibi detaylara dikkat etmek önemlidir.
Parçalandıktan sonra, bu teknik Hirschsprung hastalığının tanısını desteklemek için pediatrik cerrahi alanında araştırmaların önünü açacaktır.
