Cette méthode peut aider à répondre aux questions dans le diagnostic de Hirschsprung' la maladie de s. La méthode et les fonctions de cette technique, si vous suivez le protocole, montre une sensibilité élevée et les taux de spécificité qui se suivent en même temps. Mijing Fang, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez par fixer les biopsies d’aspiration rectale en cinq fois le volume du tissu en paraformaldéhyde de 4% pendant six heures à température ambiante. Déshydratez les tissus fixes dans un déshydrateur pathologique de tissu pendant 11 heures et intégriez les tissus rectals traités de biopsie d’aspiration dans des blocs de paraffine. Coupez les blocs sur une microtome jusqu’à ce qu’un plan de section complet du tissu soit exposé.
Ensuite, utilisez le microtome pour obtenir une section de 0,4 micromètre du tissu incorporé. Placez-le dans de l’eau de 45 à 50 degrés Celsius pour permettre aux sections de s’étendre dans un plan plat. Transférer les sections aplaties sur des glissières en verre et les cuire au four à 60 degrés Celsius pendant trois à cinq heures.
Placez les glissières déparaffinées en deux changements de xylène de 15 minutes suivis de leur hydratation dans des immersions séquentielles de cinq minutes à l’éthanol. Rincez ensuite les glissières à l’eau purifiée par osmose inverse pendant cinq minutes supplémentaires. Pour la récupération des antigènes, placez les glissières dans un bocal de récupération Coplin et placez le bocal dans un bain préchauffé d’eau bouillante.
Après 20 minutes, laisser refroidir le bocal à température ambiante pendant environ 10 minutes et rincer délicatement les toboggans avec du PBS. Ensuite, utilisez un marqueur hydrophobe pour encercler chaque section tissulaire et placer les glissières dans une boîte humide. Pour bloquer les peroxydates, ajoutez deux ou trois gouttes de solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % sur chaque tissu et placez les glissières à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
À la fin de l’incubation, rincer les toboggans à l’aide de trois lavages PBS de cinq minutes suivis d’un blocage avec de l’albumine sérique bovine à 5 % pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, jetez l’excès d’albumine de sérum bovin et étiquetez les cellules avec 50 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, rincez les glissières avec trois lavages de trois minutes en PBS et ajoutez 50 microlitres d’exhausteur de polymère à chaque diapositive.
Après 20 minutes à 37 degrés Celsius, lavez les glissières trois fois en PBS et ajoutez 50 microlitres d’anticorps secondaires B à chaque section tissulaire. Après 30 minutes à 37 degrés Celsius, rincer les sections avec trois lavages de cinq minutes en PBS et ajouter une goutte de solution de travail DAB fraîchement préparée à chaque diapositive. Lorsque le niveau approprié de coloration brune est détecté par microscopie légère, rincez les glissières dans PBS pendant cinq minutes et ténuez les noyaux avec une goutte d’hématoxyline pendant une minute.
Retirer l’excès de tache sous un filet d’eau pendant environ 30 à 40 secondes, suivi d’un lavage de 25 à 30 secondes dans du PBS frais. Différencier les tissus en 1 % d’éthanol acide chlorhydrique pendant 10 secondes, suivi d’un lavage PBS d’une minute. Déshydratez les diapositives avec des immersions de cinq minutes dans l’ordre inverse de l’hydratation et exposez les diapositives à deux changements de xylène de cinq minutes.
Montez ensuite le bordereau de couverture à l’aide d’un montage ultra-propre et laissez sécher les glissières avant leur visualisation au microscope léger. Dans cette étude représentative de 318 patients rectal de biopsie de section, 99 patients ont été au commencement diagnostiqués par biopsie rectale de section. Beaucoup de cellules de ganglion qui expriment la calretinine ont été observées dans les biopsies normales de tissu.
Cependant, aucune cellule ganglionnaire n’a été détectée dans n’importe quelle zone du tissu des segments de la maladie de Hirschsprung. L’immunostaining de S-100 et de PGP9.5 a indiqué les troncs hypertrophiés de nerf dans le submucosa du tissu maladie avec seulement la coloration granulaire de quelques petites brindilles nerveuses observées dans l’intestin normalement innervé. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de prêter attention aux détails comme la taille des biopsies d’aspiration rectale et l’épaisseur des sections.
Après sa défragmentation, cette technique ouvrira la voie à des recherches dans le domaine de la chirurgie pédiatrique pour soutenir un diagnostic de hirschsprung' la maladie de s.
