שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות באבחון מחלת הירשפרונג. השיטה והפונקציות של טכניקה זו, אם אתה עוקב אחר הפרוטוקול, מפגין רגישות גבוהה ואת שיעורי הספציפיות אשר מעבדים בו זמנית. הדגמת ההליך תהיה מייז'ינג פאנג, טכנאי מהמעבדה שלי.
התחל על ידי תיקון ביופסיות יניקה רקטלית בחמש פעמים את נפח הרקמה ב 4% paraformaldehyde במשך שש שעות בטמפרטורת החדר. לייבש את הרקמות הקבועות במייבש רקמה פתולוגי במשך 11 שעות ולהטמיע את רקמות ביופסיה יניקה רקטלי מעובד בלוקים פרפין. חותכים את הבלוקים על microtome עד מישור קטע שלם של הרקמה נחשפת.
לאחר מכן השתמש במיקרוטום כדי להשיג 0.4 מקטעי מיקרומטר של הרקמה המוטבעת. מניחים במים של 45 עד 50 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחלקים להתפשט לתוכנית שטוחה. מעבירים את החלקים השטוחים על מגלשות זכוכית ואופים אותם בתנור של 60 מעלות במשך שלוש עד חמש שעות.
מניחים את השקופיות deparaffinized לתוך שני שינויים של 15 דקות של קצילן ואחריו הידרציה שלהם ברצף חמש דקות אתנול טבילות. לאחר מכן לשטוף את המגלשות במים מטוהרים אוסמוזה הפוכה במשך חמש דקות נוספות. לאחזור אנטיגן, מניחים את המגלשות בצנצנת מכתים קופלין של פתרון אחזור ומ מניחים את הצנצנת באמבטיה שחומם מראש של מים רותחים.
לאחר 20 דקות, אפשר לצנצנת להתקרר לטמפרטורת החדר במשך כ -10 דקות ולשטוף בעדינות את השקופיות עם PBS. לאחר מכן השתמשו בסמן הידרופובי כדי להקיף כל קטע רקמה ולהמקם את השקופיות בקופסה רטובה. כדי לחסום את כל peroxidates, להוסיף שתיים או שלוש טיפות של 3% פתרון מי חמצן על כל רקמה ולמקום את השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם שלוש שטיפות PBS חמש דקות ואחריו חסימה עם אלבומין סרום 5% bovine במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השלך את אלבומין סרום השד העודף ותייג את התאים עם 50 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין ב 4 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את השקופיות עם שלוש דקות לשטוף PBS ולהוסיף 50 microliters של משפר פולימר לכל שקופית.
לאחר 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים PBS ולהוסיף 50 microliters של נוגדן משני B לכל קטע רקמה. לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את החלקים עם שלוש שטיפות חמש דקות PBS ולהוסיף טיפה של פתרון עבודה DAB מוכן טרי לכל שקופית. כאשר הרמה המתאימה של כתמים חומים מזוהה על ידי מיקרוסקופיה קלה, לשטוף את השקופיות PBS במשך חמש דקות וכתם מונה הגרעינים עם טיפה אחת של hematoxylin במשך דקה אחת.
הסר את הכתם העודף תחת טפטוף של מים במשך כ 30 עד 40 שניות ואחריו לשטוף 25 עד 30 השני PBS טרי. להבדיל את הרקמות 1% אתנול חומצה הידרוכלורית במשך 10 שניות ואחריו לשטוף PBS דקה אחת. ייבשו את השקופיות עם טבילות של חמש דקות בסדר ההפוך של הידרציה וחשפו את השקופיות לשני שינויים של חמש דקות של קצילן.
לאחר מכן תן את החלקת המכסה באמצעות הרכבה נקייה במיוחד ואפשר לשקופיות להתייבש לפני ההדמיה שלהן במיקרוסקופ קל. במחקר מייצג זה של 318 חולי ביופסיה סעיף רקטלי, 99 חולים אובחנו בתחילה על ידי ביופסיה סעיף רקטלי. תאי גנגליון רבים המבטאים קלרטינין נצפו בביופסיות רקמות תקינות.
עם זאת, לא זוהו תאי גנגליון בשום אזור של הרקמה ממקטעי המחלה של הירשפרונג. S-100 ו PGP9.5 immunostaining גילה גזעי עצבים היפרטרופיים בתת-מוזה של הרקמה המחלה עם כתמים פרטניים בלבד של כמה זרדים עצביים קטנים שנצפו במעי הפנימי בדרך כלל. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשים לב לפרטים כמו גודל ביופסיות יניקה רקטלי ועובי של חלקים.
לאחר איחוי, טכניקה זו תסלול את הדרך למחקרים בתחום ניתוחי ילדים לתמיכה באבחון מחלת הירשפרונג.
