Этот метод может помочь ответить на вопросы в диагностике болезни Гиршпрунга. Метод и функции этого метода, если следовать протоколу, демонстрируют высокую чувствительность и скорость специфичности, которые обработать в то же время. Демонстрацией процедуры будет Mijing Fang, техник из моей лаборатории.
Начните с фиксации биопсии всасывания прямой кишки в пять раз больше объема ткани в 4%paraformaldehyde в течение шести часов при комнатной температуре. Обезвоживание фиксированных тканей в обезвоживании патологических тканей в течение 11 часов и вставлять обработанные ткани ректального всасывания биопсии в парафиновых блоков. Обрезать блоки на микротоме до полного участка плоскости ткани подвергается.
Затем используйте микротом для получения 0,4 микрометровых секций встроенной ткани. Поместите в 45 до 50 градусов по Цельсию воды, чтобы разделы распространяться в плоский план. Перенесите сплющенные секции на стеклянные горки и выпекайте их в духовке 60 градусов по Цельсию в течение трех-пяти часов.
Поместите депарафинизированные слайды в два 15-минутных изменения ксилена с последующим их гидратацией в последовательных пятиминутных погружениях этанола. Затем промыть горки в обратном осмоса очищенной воды в течение еще пяти минут. Для поиска антигена поместите слайды в банку coplin окрашивания раствора поиска и поместите банку в разогретую ванну с кипящей водой.
Через 20 минут дайте банку остыть до комнатной температуры в течение 10 минут и аккуратно промойте горки с помощью PBS. Затем используйте гидрофобный маркер, чтобы окружить каждую секцию ткани и поместить слайды во влажную коробку. Чтобы блокировать любые пероксидаты, добавьте две или три капли 3%перекиси водорода раствора на каждой ткани и поместите слайды при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
В конце инкубации, промыть слайды с тремя пятиминутными PBS моет с последующим блокированием с 5%бычьей сыворотки альбумин в течение 20 минут при 37 градусов по Цельсию. Затем отбросьте избыток альбумин сыворотки крупного рогатого скота и обозначить клетки 50 микролитров первичного антитела, представляющих интерес при 4 градусах Цельсия в одночасье. На следующее утро, промыть слайды с трех трехминутных моет в PBS и добавить 50 микролитров полимерного усилителя для каждого слайда.
Через 20 минут при 37 градусах по Цельсию, мыть слайды три раза в PBS и добавить 50 микролитров вторичного антитела B к каждой части ткани. Через 30 минут при 37 градусах по Цельсию, промойте секции с тремя пятиминутными моет в PBS и добавить каплю свежеприготовленного DAB рабочего решения для каждого слайда. Когда соответствующий уровень коричневого окрашивания обнаруживается световой микроскопии, промыть слайды в PBS в течение пяти минут и счетчик пятно ядер с одной каплей гематоксилина в течение одной минуты.
Удалите избыток пятна под струйкой воды в течение примерно 30 до 40 секунд, а затем от 25 до 30 секунд мыть в свежем PBS. Дифференцируйте ткани в 1% этанола соляной кислоты в течение 10 секунд с последующим одноминутным промывки PBS. Обезвоживайте горки пятиминутными погружениями в обратном порядке гидратации и подвергайте слайды двум пятиминутным изменениям ксилена.
Затем смонтировать крышку скольжения с помощью ультра-чистой монтажа и позволить слайды высохнуть до их визуализации на световом микроскопе. В этом репрезентативном исследовании 318 пациентов биопсии ректальной секции, 99 пациентов были первоначально диагностированы ректальной биопсии секции. Многие клетки ганглия, которые выражают кальцинин были замечены в нормальной биопсии тканей.
Однако, никакие клетки ганглия не были обнаружены в любой области ткани от сегментов болезни Hirschsprung. S-100 и PGP9.5 иммуностимулирования показали гипертрофированных нервных стволов в submucosa больной ткани только гранулированное окрашивание некоторых мелких нервных веток наблюдается в обычно иннерватированный кишечник. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы обратить внимание на детали, такие как размер ректальной биопсии всасывания и толщина секций.
После того, как он дефрагментирован, этот метод проложит путь для исследований в области детской хирургии, чтобы поддержать диагноз болезни Гиршпрунга.
