Este método pode ajudar a responder perguntas no diagnóstico da doença de Hirschsprung. O método e as funções desta técnica, se você seguir o protocolo, exibe alta sensibilidade e as taxas de especificidade que processam ao mesmo tempo. Demonstrando o procedimento estará Mijing Fang, um técnico do meu laboratório.
Comece fixando as biópsias de sucção retal em cinco vezes o volume do tecido em 4% de paraformaldeído por seis horas à temperatura ambiente. Desidrate os tecidos fixos em um desidratador de tecido patológico por 11 horas e incorpore os tecidos de biópsia de sucção retal processados em blocos de parafina. Corte os blocos em um microtómeo até que um plano de seção completa do tecido seja exposto.
Em seguida, use o microtoma para obter uma seção de 0,4 micrômetros do tecido incorporado. Coloque em água de 45 a 50 graus Celsius para permitir que as seções se espalhem em um plano plano. Transfira as seções achatadas em lâminas de vidro e assá-las em um forno Celsius de 60 graus por três a cinco horas.
Coloque os slides desparaffinizados em duas mudanças de 15 minutos de xileno seguidos de sua hidratação em imersões sequenciais de cinco minutos de etanol. Em seguida, enxágue os slides em água purificada de osmose reversa por mais cinco minutos. Para recuperação de antígenos, coloque os slides em um frasco de coloração Coplin de solução de recuperação e coloque o frasco em um banho pré-aquecido de água fervente.
Após 20 minutos, deixe o frasco esfriar até a temperatura ambiente por cerca de 10 minutos e enxágue suavemente os slides com PBS. Em seguida, use um marcador hidrofóbico para cercar cada seção de tecido e coloque os slides em uma caixa molhada. Para bloquear qualquer peroxidato, adicione duas ou três gotas de solução de peróxido de hidrogênio de 3% em cada tecido e coloque os slides a 37 graus Celsius por 20 minutos.
No final da incubação, enxágue os slides com três lavagens pbs de cinco minutos seguidas de bloqueio com albumina de soro bovino de 5% por 20 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, descarte o excesso de albumina de soro bovino e rotule as células com 50 microliters do anticorpo primário de interesse a 4 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, enxágue os slides com três lavagens de três minutos em PBS e adicione 50 microliters de melhorador de polímero a cada slide.
Após 20 minutos a 37 graus Celsius, lave os slides três vezes em PBS e adicione 50 microliters de anticorpo secundário B a cada seção de tecido. Depois de 30 minutos a 37 graus Celsius, enxágue as seções com três lavagens de cinco minutos em PBS e adicione uma gota de solução de trabalho DAB recém-preparada para cada slide. Quando o nível apropriado de coloração marrom for detectado por microscopia leve, enxágue os slides em PBS por cinco minutos e contrapeso a mancha dos núcleos com uma gota de hematoxilina por um minuto.
Remova o excesso de mancha sob uma gota de água por aproximadamente 30 a 40 segundos seguido de uma lavagem de 25 a 30 segundos em PBS fresco. Diferencie os tecidos em 1% etanol de ácido clorídrico por 10 segundos seguido de uma lavagem pbs de um minuto. Desidrate os slides com imersões de cinco minutos na ordem inversa de hidratação e exponha os slides a duas mudanças de cinco minutos de xileno.
Em seguida, monte o deslizamento da tampa usando montagem ultra-limpa e deixe os slides secarem antes de sua visualização em um microscópio leve. Neste estudo representativo de 318 pacientes com biópsia de seção retal, 99 pacientes foram inicialmente diagnosticados por biópsia da seção retal. Muitas células de gânglio que expressam calretina foram observadas em biópsias normais de tecido.
No entanto, nenhuma célula de gânglio foi detectada em qualquer área do tecido dos segmentos da doença de Hirschsprung. A imunossutaining S-100 e PGP9.5 revelou troncos nervosos hipertropidos na submucosa do tecido doente com apenas coloração granular de alguns pequenos galhos nervosos observados no intestino normalmente inervado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de prestar atenção a detalhes como tamanho de biópsias de sucção retal e espessura de seções.
Após ser desfragmentada, essa técnica abrirá caminho para pesquisas no campo da cirurgia pediátrica para apoiar o diagnóstico da doença de Hirschsprung.
