이 방법은 허쉬스프룽병 진단에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 프로토콜을 따르는 경우 이 기술의 방법과 기능은 높은 감도 및 동시에 처리하는 특이성 비율을 나타낸다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 Mijing Fang이 될 것입니다.
실온에서 6시간 동안 4%의 파라포름알데히드에서 조직의 5배 의 부피로 직장 흡입 생검을 고정하는 것으로 시작한다. 병리학 적 조직 탈수기에서 고정 된 조직을 11 시간 동안 탈수하고 파라핀 블록에 처리 된 직장 흡입 생검 조직을 포함시게하십시오. 조직의 전체 단면 평면이 노출 될 때까지 마이크로 토메의 블록을 다듬습니다.
그런 다음 마이크로토메를 사용하여 내장된 조직의 0.4 마이크로미터 섹션을 얻습니다. 섹션이 평평한 계획으로 확산 될 수 있도록 섭씨 45 ~ 50도의 물에 놓습니다. 평평한 부분을 유리 슬라이드에 옮기고 섭씨 60도 오븐에서 3~5시간 동안 굽습니다.
탈파보정 된 슬라이드를 자일렌의 두 가지 15 분 변경 사항으로 두 다음 순차적으로 5 분 에탄올 몰입에 수분을 넣습니다. 그런 다음 슬라이드를 역 삼투압 정제 수로 헹구면 추가로 5분간 헹구십시오. 항원 회수의 경우, 슬라이드를 코플린 염색 용액의 코플린 염색 항아리에 넣고 항아리를 끓는 물의 예열된 목욕에 넣습니다.
20분 후, 항아리가 실온에서 약 10분 동안 식히고 PBS로 슬라이드를 부드럽게 헹구십시오. 그런 다음 소수성 마커를 사용하여 각 조직 섹션을 둘러싸고 슬라이드를 젖은 상자에 넣습니다. 과산화물을 차단하려면 각 조직에 과산화수소 용액의 2~3방울을 넣고 슬라이드를 섭씨 37도에서 20분 동안 배치합니다.
인큐베이션이 끝나면 5분 PBS 세정3개로 슬라이드를 헹구고 섭씨 37도에서 20분 동안 5%의 소 세럼 알부민을 블로킹합니다. 다음으로, 여분의 소 혈청 알부민을 버리고 하룻밤 사이에 관심있는 1 차 항체의 50 마이크로 리터로 세포를 라벨. 다음 날 아침, PBS에서 3분 동안 세 번의 세정으로 슬라이드를 헹구고 각 슬라이드에 50 마이크로리터의 폴리머 인핸서를 추가합니다.
섭씨 37도에서 20분 후, PBS에서 슬라이드를 세 번 세척하고 각 조직 섹션에 이차 항체 B의 50 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 후 PBS에서 5분간 세번 의 세정으로 섹션을 헹구고 각 슬라이드에 갓 준비된 DAB 작업 용액한 한 방울을 추가합니다. 가벼운 현미경 검사법에 의해 적절한 수준의 갈색 염색이 감지되면 PBS에서 슬라이드를 5 분 동안 헹구고 1 분 동안 헤마톡시린 한 방울로 핵을 염색합니다.
약 30~40초 동안 물 방울 아래에서 과도한 얼룩을 제거하고 신선한 PBS에서 25~30초 세척합니다. 1%의 염산 에탄올로 10초 간 조직을 구별한 다음 1분 PBS 세척을 합니다. 수분 공급의 역순으로 5분 짜리 몰입으로 슬라이드를 탈수하고 슬라이드를 자일렌의 5분 교체 2개에 노출시합니다.
그런 다음 매우 깨끗한 마운팅을 사용하여 커버 슬립을 장착하고 가벼운 현미경에서 시각화하기 전에 슬라이드가 건조할 수 있도록 합니다. 318명의 직장 단면도 생검 환자를 위한 이 대표적인 연구 결과에서는, 99명의 환자는 처음에 직장 단면도 생검에 의해 진단되었습니다. 칼레티닌을 표현하는 많은 신경절 세포는 일반적인 조직 생검에서 관찰되었습니다.
그러나, Hirschsprung의 질병 세그먼트에서 조직의 어떤 영역에서 신경절 세포도 검출되지 않았습니다. S-100 및 PGP9.5 면역염색은 일반적으로 내면화된 장에서 관찰되는 몇몇 작은 신경 나뭇가지의 단지 과립적인 얼룩을 가진 병인 조직의 병은 조직에 있는 비대 신경 트렁크를 밝혔습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 직장 흡입 생검의 크기와 섹션의 두께와 같은 세부 사항에주의를 기울이는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
그것은 조각 모음 후, 이 기술은 허쉬 스프룽의 질병의 진단을 지원하기 위해 소아 수술 분야에서 연구를위한 길을 열 것입니다.
