Это самый быстрый и правильный протокол для мониторинга подкисления кишечника дрозофилы с надежными и достоверными результатами. Этот метод поможет определить роль подкисления кишечника у нескольких организмов. И это явление Заключается в том, что простота данной техники является главным преимуществом.
Таким образом, он может быть использован для немодельных организмов. Этот метод может контролировать высвобождение кислоты для многих систем, включая клеточные линии и 3D на живых культурах. Эта техника проста с минимальными усилиями.
Пища, содержащая бромфенол синий, должна быть приготовлена свежей. Кроме того, при рассечении кишечник не должен растягиваться. Начните организацию анализа подкисления кишечника с приготовления пищи мухи с рН-чувствительным бромфеноловым синим или BPB красителем.
Для этого растопите корм мух в микроволновой печи и дайте ей остыть до теплого состояния. Добавьте один миллилитр 4% BPB к одному миллилитру теплой пищи с хорошим перемешиванием. Используя пипетку, добавьте пищу мухи, содержащую BPB, в одну точку примерно 200 микролитров в центре чашки Петри.
Затем соберите от нуля до двух дней недевичьих самок Мух Drosophila melanogaster и позвольте мухам восстановиться на стандартной кукурузной муке. Перед экспериментом голодайте мух в течение 24 часов при комнатной температуре во флаконе, содержащем лабораторную салфетку, пропитанную примерно двумя миллилитрами деионизированной воды. Переложите голодных мух в чашку Петри, содержащую одиночные точки свежеприготовленной пищи для мух, дополненную 2% BPB, чтобы позволить мухам кормиться в течение четырех часов при комнатной температуре при воздействии света.
Через четыре часа соберите мух, затем приступайте к хирургическому выделению кишок обезболенных мух в 1X PBS щипцами под стереомикроскопом. Подсчитайте количество мух, которые показывают прочный BPB, стоящий в кишках, и рассчитайте процент, используя уравнение. После вскрытия установите образцы в PBS на стеклянную горку и поместите подготовленный слайд под микроскоп.
Затем отрегулируйте фокус с помощью IPS. После этого отключите IPS, чтобы открыть затвор для камеры. После рассечения кишечника было обнаружено, что некоторые самки мух Drosophila melanogaster производят кислоту, о чем свидетельствует желтый цвет в CCR кишечника.
В то время как кишечник некоторых мух был синим, что свидетельствует о неспособности мух подкислять свои кишки. В течение 30 минут примерно 20% мух подкисили кишечник. Через час 40% кишечника показали подкисление, в то время как после двух-трех часов кормления процент подкисленных кишок увеличился до 60-70%.
Не наблюдалось различий в подкислении кишечника для двух различных температурных условий. Эффективность протокола подкисления кишечника оценивалась у различных видов дрозофил. Все протестированные виды показали сильное подкисление кишечника, предполагая, что протокол может быть применен к другим организмам.
Самое главное, что нужно помнить, это поместить звездную муху в пластину Петри с дрожжами и бромфенолом синего цвета на четыре часа. Этот метод поможет понять основную биологию и клеточный путь, участвующий в подкислении кишечника. Это также должно помочь определить мишень препарата для создания заболеваний, связанных с подкислением кишечника.
