Este é o protocolo mais rápido e certo para monitorar a acidificação intestinal de Drosophila com resultados robustos e autênticos. Este método ajudará a determinar o papel da acidificação intestinal em múltiplos organismos. E esse fenômeno é a simplicidade dessa técnica é a principal vantagem.
Como tal, pode ser utilizado para organismos não-modelo. Este método pode monitorar a liberação de ácido para muitos sistemas, incluindo as linhas celulares e 3D em culturas ao vivo. Esta técnica é simples com o mínimo de esforço.
Os alimentos que contenham azul bromofenol devem ser preparados frescos. Além disso, enquanto o intestino de dissecção não deve ser esticado. Comece a organizar o ensaio de monitoramento da acidificação intestinal com a preparação do alimento de mosca com pH sensoriando azul bromofenol ou corante BPB.
Para isso, derreta a comida de mosca em um micro-ondas e deixe esfriar até ficar morno. Adicione um mililitro de 4%BPB a um mililitro da comida morna com um poço de mistura. Usando uma pipeta, adicione o alimento de mosca contendo BPB em um único ponto de aproximadamente 200 microliters no centro de uma placa de petri.
Em seguida, colete moscas drosophila melanogaster não virgem de zero a dois dias de idade, e permita que as moscas se recuperem em alimentos padrão de farinha de milho. Antes do experimento, passe a fome as moscas por 24 horas à temperatura ambiente em um frasco contendo um tecido limpo de laboratório encharcado com aproximadamente dois mililitros de água deionizada. Transfira moscas famintas em uma placa de petri contendo pontos únicos dos alimentos de mosca recém-preparados, complementados com 2%de BPB, para permitir que as moscas forrageiam por quatro horas à temperatura ambiente enquanto expostas à luz.
Depois de quatro horas coletar as moscas, em seguida, proceder a isolar cirurgicamente as entranhas das moscas anestesiadas em 1X PBS com fórceps sob um microscópio estéreo. Conte o número de moscas que mostram BPB robusto em pé nas entranhas, e calcule a porcentagem usando a equação. Após a dissecação, monte as amostras em PBS em um slide de vidro e coloque o slide preparado sob o microscópio.
Em seguida, ajuste o foco usando o IPS. Uma vez feito, desligue o IPS para abrir o obturador para a câmera. Após dissecção intestinal, algumas moscas fêmeas de drosophila melanogaster foram encontradas para produzir ácido, como indicado pela cor amarela na CCR do intestino.
Enquanto os intestinos de algumas moscas eram azuis sugerindo uma falha das moscas para acidificar suas entranhas. Em 30 minutos, aproximadamente 20% das moscas acidificaram o intestino. Após uma hora, 40% das tripas intestinais apresentaram acidificação, enquanto após duas a três horas de alimentação, a porcentagem de tripas acidificadas aumentou para 60 a 70%Quase 90 a 95% das entranhas foram acidificadas quando moscas foram alimentadas por quatro horas.
Não foi observada diferença na acidificação intestinal para duas condições de temperatura diferentes. A eficiência do protocolo de acidificação intestinal foi avaliada em várias espécies de Drosophila. Todas as espécies testadas apresentaram acidificação intestinal robusta, sugerindo que o protocolo pode ser aplicado a outros organismos.
A coisa mais importante a se lembrar é colocar a estrela voa na placa de petri com levedura e azul Bromophenol por quatro horas. Essa técnica ajudará a entender a biologia básica e o caminho celular envolvidos na acidificação intestinal. Também deve ajudar a identificar o alvo da droga para criar as doenças relacionadas à acidificação intestinal.
