Questo è il protocollo più veloce e giusto per monitorare l'acidificazione intestinale di Drosophila con risultati robusti e autentici. Questo metodo aiuterà a determinare il ruolo dell'acidificazione intestinale in più organismi. E questo fenomeno è La semplicità di questa tecnica è il vantaggio principale.
Come tale, può essere utilizzato per gli organismi non modello. Questo metodo può monitorare il rilascio di acido per molti sistemi, comprese le linee cellulari e il 3D su colture vive. Questa tecnica è semplice con il minimo sforzo.
Il cibo contenente blu di bromofenolo deve essere preparato fresco. Inoltre, mentre l'intestino di dissezione non deve essere allungato. Inizia a organizzare il test di monitoraggio dell'acidificazione intestinale con la preparazione del cibo per mosche con il sensore di pH Bromophenol blue o BPB dye.
Per fare ciò, sciogliere il cibo a mosca in un forno a microonde e lasciarlo raffreddare fino a quando non è tiepido. Aggiungere un millilitro di 4% BPB a un millilitro di cibo tiepido con un po 'di miscelazione. Usando una pipetta, aggiungi il cibo per mosche contenente BPB in un singolo punto di circa 200 microlitri al centro di una capsula di Petri.
Quindi, raccogli da zero a due giorni le mosche femmina non vergine Drosophila melanogaster e consenti alle mosche di recuperare sul cibo standard per la farina di mais. Prima dell'esperimento, affamare le mosche per 24 ore a temperatura ambiente in una fiala contenente un tessuto di salviette da laboratorio imbevuto di circa due millilitri di acqua deionizzata. Trasferisci le mosche affamate in una capsula di Petri contenente singoli punti del cibo per mosche appena preparato, integrato con il 2% di BPB, per consentire alle mosche di foraggiare per quattro ore a temperatura ambiente mentre sono esposte alla luce.
Dopo quattro ore raccogliere le mosche, quindi procedere a isolare chirurgicamente le viscere delle mosche anestetizzate in 1X PBS con pinza sotto stereomicroscopio. Conta il numero di mosche che mostrano un robusto BPB in piedi nelle viscere e calcola la percentuale usando l'equazione. Dopo la dissezione, montare i campioni in PBS su un vetrino e posizionare il vetrino preparato sotto il microscopio.
Quindi regolare la messa a fuoco utilizzando l'IPS. Una volta fatto, spegnere l'IPS per aprire l'otturatore per la fotocamera. Dopo la dissezione intestinale, alcune mosche femmine di Drosophila melanogaster sono state trovate a produrre acido come indicato dal colore giallo nel CCR dell'intestino.
Mentre l'intestino di alcune mosche era blu suggerendo un fallimento delle mosche nell'acidificare le loro viscere. Entro 30 minuti, circa il 20% delle mosche aveva acidificato l'intestino. Dopo un'ora, il 40% delle budella intestinali ha mostrato acidificazione, mentre dopo due o tre ore di alimentazione, la percentuale di budella acidificata è aumentata dal 60 al 70%Quasi il 90-95% delle viscere è stato acidificato quando le mosche sono state alimentate per quattro ore.
Non è stata osservata alcuna differenza nell'acidificazione intestinale per due diverse condizioni di temperatura. L'efficacia del protocollo di acidificazione intestinale è stata valutata in varie specie di Drosophila. Tutte le specie testate hanno mostrato una robusta acidificazione intestinale, suggerendo che il protocollo può essere applicato ad altri organismi.
La cosa più importante da ricordare è posizionare le mosche della stella nella piastra di Petri con lievito e blu bromofenolo per quattro ore. Questa tecnica aiuterà a comprendere la biologia di base e il percorso cellulare coinvolto nell'acidificazione intestinale. Dovrebbe anche aiutare a identificare il bersaglio del farmaco per creare le malattie legate all'acidificazione intestinale.
