Dies ist das schnellste und richtige Protokoll zur Überwachung der Drosophila-Darmversauerung mit robusten und authentischen Ergebnissen. Diese Methode wird helfen, die Rolle der Darmversauerung in mehreren Organismen zu bestimmen. Und dieses Phänomen ist Die Einfachheit dieser Technik ist der Hauptvorteil.
Als solches kann es für die Nicht-Modellorganismen verwendet werden. Diese Methode kann die Säurefreisetzung für viele Systeme überwachen, einschließlich der Zelllinien und 3D auf lebenden Kulturen. Diese Technik ist einfach mit minimalem Aufwand.
Lebensmittel, die Bromphenolblau enthalten, sollten frisch zubereitet werden. Darüber hinaus sollte der Darm während der Dissektion nicht gedehnt werden. Beginnen Sie mit der Organisation des Darmsäuerungsmonitoring-Assays mit der Zubereitung des Fliegenfutters mit pH-Messstoff Bromphenolblau oder BPB-Farbstoff.
Schmelzen Sie dazu das Fliegenfutter in der Mikrowelle und lassen Sie es lauwarm abkühlen. Einen Milliliter 4%BPB zu einem Milliliter des lauwarmen Futters mit einer Mischmulde geben. Fügen Sie mit einer Pipette das BPB-haltige Fliegenfutter in einen einzigen Punkt von etwa 200 Mikrolitern in der Mitte einer Petrischale hinzu.
Als nächstes sammeln Sie null bis zwei Tage alte nicht-jungfräuliche weibliche Drosophila melanogaster Fliegen und lassen Sie die Fliegen sich auf Standard-Maismehlfutter erholen. Vor dem Experiment verhungern die Fliegen für 24 Stunden bei Raumtemperatur in einer Durchstechflasche, die ein Laborwischtuch enthält, das mit etwa zwei Millilitern entionisiertem Wasser getränkt ist. Übertragen Sie verhungerte Fliegen in eine Petrischale mit einzelnen Punkten des frisch zubereiteten Fliegenfutters, ergänzt mit 2% BPB, damit die Fliegen vier Stunden bei Raumtemperatur suchen können, während sie Licht ausgesetzt sind.
Nach vier Stunden sammeln Sie die Fliegen und isolieren Sie dann chirurgisch die Eingeweide der betäubten Fliegen in 1X PBS mit Pinzette unter einem Stereomikroskop. Zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die einen robusten BPB zeigen, der in den Eingeweiden steht, und berechnen Sie den Prozentsatz anhand der Gleichung. Montieren Sie die Proben nach der Dissektion in PBS auf einem Glasobjektträger und legen Sie den vorbereiteten Objektträger unter das Mikroskop.
Passen Sie dann den Fokus mit dem IPS an. Sobald Sie fertig sind, schalten Sie das IPS aus, um den Verschluss für die Kamera zu öffnen. Nach der Darmdissektion wurde festgestellt, dass einige weibliche Fliegen von Drosophila melanogaster Säure produzieren, wie die gelbe Farbe in der CCR des Darms anzeigt.
Während der Darm einiger Fliegen blau war, was auf ein Versagen der Fliegen hindeutet, ihre Eingeweide zu übersäuern. Innerhalb von 30 Minuten hatten etwa 20% der Fliegen den Darm angesäuert. Nach einer Stunde zeigten 40% der Eingeweide eine Übersäuerung, während nach zwei bis drei Stunden Fütterung der Prozentsatz der angesäuerten Eingeweide auf 60 bis 70% anstieg Fast 90 bis 95% der Eingeweide waren angesäuert, wenn Fliegen vier Stunden lang gefüttert wurden.
Es wurde kein Unterschied in der Darmversauerung für zwei verschiedene Temperaturbedingungen beobachtet. Die Wirksamkeit des Darmversauerungsprotokolls wurde bei verschiedenen Drosophila-Spezies bewertet. Alle getesteten Arten zeigten eine robuste Darmversauerung, was darauf hindeutet, dass das Protokoll auf andere Organismen angewendet werden kann.
Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, die Sternfliegen mit Hefe und Bromphenolblau für vier Stunden in die Petriplatte zu legen. Diese Technik wird helfen, die grundlegende Biologie und den zellulären Weg zu verstehen, die an der Versauerung des Darms beteiligt sind. Es sollte auch helfen, das Wirkstoffziel zu identifizieren, um die mit der Darmversauerung verbundenen Krankheiten zu erzeugen.
